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胚胎干细胞分化的心肌细胞与癌细胞共培养方法

  胚胎干细胞分化的心肌细胞与癌细胞共培养方法的建立及抗癌药物心脏毒性评价研究

  

  目的本课题采用细胞共培养方法,将人胚胎干细胞分化的心肌细胞(hESC-CM)分别与人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MCF7)共培养,对抗癌药物的心脏毒性进行实验研究。

  

  实验通过观察抗癌药物在杀灭癌细胞的同时是否产生心肌细胞毒性,进而来早期预测抗癌药物的心脏毒性,为新药临床前安全性评价提供数据支持方法研究所用的抗癌药物为阿霉素(Doxorubicin)、马钱子碱(Brucine)和5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)。

  

  所用的细胞为人胚胎干细胞分化的心肌细胞(hESC-CM)、人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MCF7)。

  

  1.采用酶联免疫检测仪测定给药后癌细胞的存活率,从而确定共培养的给药浓度。

  

  2.采用流式细胞仪测定hESC-CM细胞和HepG2、MCF7细胞共培养给药后4h、24h、48h心肌细胞和癌细胞的凋亡率,从而确定不同浓度药物对共培养的两种细胞共同的损伤作用。

  

  3.采用实时细胞分析仪及其配套的特殊细胞培养板(Insert)分别测定:(1)未给药时,单独培养和与癌细胞共培养1h、4h、12h、24h、36h、48h六个作用时间点的hESC-CM细胞搏动频率(Beating Rate)、搏动振幅(Amplitude)的变化。

  

  (2)单独培养hESC-CM细胞给予抗癌药后1h、4h、12h、24h、36h、48h,hESCCM细胞搏动频率、搏动振幅的变化。

  

  (3)hESC-CM细胞分别与HepG2、MCF7细胞共培养,给予抗癌药后1h、4h、12h、24h、36h、48h,hESC-CM细胞搏动频率、搏动振幅的变化。

  

  从而确定抗癌药分别对单独和共培养系统中hESC-CM搏动功能的影响。

  

  4.采用高内涵细胞成像仪(IN Cell 2000)并结合荧光探针Mitotracker、Hoechst33342对hESC-CM细胞进行染色,分别检测:(1)未给药时,单独培养和与癌细胞共培养4h、24h、48h的hESC-CM细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential)的变化。

  

  (2)单独培养hESC-CM细胞给予抗癌药后4h、24h、48h,hESC-CM细胞线粒体膜电位的变化。

  

  (3)hESC-CM细胞分别与HepG2、MCF7细胞共培养,给予抗癌药后4h、24h、48h,hESC-CM细胞线粒体膜电位的变化。

  

  从而确定抗癌药分别对单独和共培养系统中hESC-CM细胞线粒体膜电位的影响。

  

  结果1.酶联免疫检测仪测定给药后癌细胞的存活率,设定药物浓度分别为:阿霉素为0.03μmol•L-1、0.1μmol•L-1、0.3μmol•L-1、1.0μmol•L-1、3μmol•L-1、10μmol•L-1;马钱子碱为6.25μmol•L-1、12.5μmol•L-1、25μmol•L-1、50μmol•L-1、100μmol•L-1、200μmol•L-1;5-氟尿嘧啶为25μmol•L-1、50μmol•L-1、100μmol•L-1、200μmol•L-1、400μmol•L-1、800μmol•L-1。

  

  2.流式细胞分析仪测定共培养细胞的凋亡率,结果显示:与对照组相比,随着药物作用浓度的增加,阿霉素作用后hESC-CM和HepG2、MCF7的凋亡率逐渐增大;马钱子碱对心肌细胞和癌细胞的毒性较弱,但存在统计学差异;5-氟尿嘧啶对癌细胞的杀伤作用高于心肌细胞。

  

  3.采用实时细胞分析仪测定时,共培养的心肌细胞的与单独培养的心肌细胞相比表现为搏动频率下降、搏动振幅上升。

  

  采用高内涵细胞成像仪测定时,与心肌细胞单独培养对比时,共培养4h和24h后,心肌细胞的线粒体膜电位没有明显的变化;在共培养48h后,心肌细胞线粒体膜电位下降。

  

  4.hESC-CM和HepG2共培养体系(1)给予阿霉素后,与对照组相比,共培养心肌细胞搏动功能变化明显。

  

  在给药后12h、24h、36h和48h出现搏动紊乱;高浓度阿霉素降低共培养心肌细胞的线粒体膜电位。

  

  (2)给予马钱子碱后,与对照组相比,100μmol•L-1、200μmol•L-1的马钱子碱使心肌细胞搏动频率和搏动振幅在1h、4h明显降低,在给药12h后逐渐恢复;100μmol•L-1、200μmol•L-1的马钱子碱在4h和24h会降低线粒体膜电位。

  

  (3)给予5-氟尿嘧啶后,与对照组相比,在给药后1h、4h、12h对心肌细胞的作用没有统计学差异,在给药后24h、36h和48h 5-氟尿嘧啶可以明显降低心肌细胞的搏动频率和搏动振幅;800μmol•L-1的5-氟尿嘧啶在给药24h和48h降低心肌细胞的线粒体膜电位。

  

  5.hESC-CM和MCF7共培养体系(1)给予阿霉素后,与对照组相比,共培养心肌细胞搏动功能变化明显。

  

  在给药后12h、24h、36h和48h出现心肌细胞搏动紊乱;高浓度阿霉素降低共培养心肌细胞的线粒体膜电位。

  

  (2)给予马钱子碱后,与对照组相比,高浓度会使心肌细胞搏动频率和搏动振幅在1h、4h明显抑制,在给药后12h逐渐恢复;50μmol•L-1、100μmol•L-1、200μmol•L-1的马钱子碱会降低线粒体膜电位。

  

  (3)给予5-氟尿嘧啶后,与对照组相比,给药后1h没有统计学差异。

  

  在给药后4h、12h,800μmol•L-15-氟尿嘧啶会降低心肌细胞的搏动频率。

  

  高浓度的5-氟尿嘧啶在24h、36h和48h可以明显降低心肌细胞的搏动频率和搏动振幅;高浓度的5-氟尿嘧啶在24h和48h明显降低心肌细胞的线粒体膜电位。

  

  6.给予三种药物后,共培养的hESC-CM细胞与单独培养的hESC-CM细胞相比,搏动功能具有不同的改变,并存在统计学差异。

  

  结论1.给药前,hESC-CM细胞与癌细胞共培养与单独培养相比,心肌细胞搏动功能和线粒体膜电位的变化在统计学上存在明显差异。

  

  给予抗癌药后,hESC-CM细胞与癌细胞共培养和单独培养相比,心肌细胞搏动功能和线粒体膜电位变化存在统计学差异。

  

  该方法与现有单一使用心肌细胞来评价药物心脏毒性的方法进行对比,存在差异性。

  

  2.使用共培养方法可以初步模拟体内环境,初步检测抗癌药在杀伤癌细胞的同时可能对心肌细胞产生的毒性反应。

  

  为早期抗癌药物的临床前安全性评价提供数据支持。


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