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内皮克隆形成细胞条件培养基对血管内皮细胞

  内皮克隆形成细胞条件培养基对血管内皮细胞、成纤维细胞生物行为的影响

  

  研究背景和目的研究表明,内皮克隆形成细胞(Endothelial colony-forming cells,ECFCs)移植对糖尿病创面愈合具有促进作用,但因利用率低、疗效不明确及存在伦理学争议等因素,其应用受到了阻碍。

  

  利用细胞的旁分泌效应可有效避免以上问题,因此,我们旨在深入了解ECFCs的细胞学特征以及探讨ECFCs条件培养基(Conditioned medium,CM)对于成熟血管内皮细胞和真皮成纤维细胞生物行为的影响,为ECFCs-CM在促进糖尿病创面愈合上的应用提供理论依据。

  

  方法采用密度梯度离心法从人脐带血中分离单个核细胞,将后者在特定培养环境下诱导培养出内皮克隆形成细胞,并采用流式细胞术细胞表面标志物检测、免疫荧光染色及Matrigel基质胶成管试验等对细胞进行鉴定,对比第1代和第10代细胞的表型及功能。

  

  制备无血清ECFCs-CM,并采用抗体芯片及ELISA法对其中的细胞因子进行检测。

  

  采用无血清EBM-2基础培养基作为对照,应用CCK-8法、Transwell共培养法及细胞划痕实验、Anne×inV-FITC/PI双染法流式细胞术检测 ECFCs-CM 对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和人真皮成纤维细胞(Human dermal fibroblasts,HDFs)增殖、迁移及凋亡的影响,并采用Matrigel基质胶成管实验检测ECFCs-CM对HUVECs成管能力的影响。

  

  结果原代培养的细胞呈“铺路石”样生长,细胞个体呈近椭圆形或纺锤体形,体外连续传代时,细胞形态无明显变化;流式细胞术细胞表面标志物检测结果显示第1代和第10代均高表达内皮细胞标记KDR、CD144,不表达单核巨噬细胞标记CD45,两代细胞以上三种表面标志物表达率差异无统计学意义(P>0.05),第1代细胞高表达造血干细胞标记CD34,而第10代表达率降低,差异有统计学意义(P<0.05),第1代细胞低表达干细胞标记CD133,第10代几乎不表达,差异有统计学意义(P<0.01);免疫荧光染色结果显示第1代和第10代细胞Dil-acLDL摄取及FITC-UEA-I结合双阳性;Matrigel基质胶成管试验结果显示第1代和第10代细胞均可在基质胶中可形成管腔样结构。

  

  抗体芯片检测结果显示,ECFCs-CM 高表达 PDGF-BB、Angiopoietin-2、Angiogenin、MCP-3、ICAM-2、LAP等34种细胞因子,ELISA法定量检测结果显示,ECFCs-CM中PDGF-BB、IL-8、EGF 的含量分别为 4627.42±457.51pg/ml、4111.36±129.77pg/ml、1679.71±113.35pg/ml(浓度均以 1×106cells/2ml 为标准);CCK-8 法结果显示,实验组HUVECs及HDFs在24h、48h及72h增殖活性均高于对照组(P<0.05);Transwell共培养结果显示,与对照组相比,实验组HUVECs和HDFs在单位时间内细胞迁移数均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);细胞划痕实验结果显示,与对照组相比,实验组HUVECs和HDFs迁移率在各时间点均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);流式细胞术结果显示,实验组HUVECs晚期凋亡、死亡率低于对照组(P<0.01),实验组HDFs早期凋亡和晚期凋亡、死亡率均低于对照组(P<0.05);Matrigel基质胶成管实验结果显示,与对照组相比,实验组HUVECs在基质胶上形成管状结构和节点数目均提高,差异有统计学意义(P<0.01)。

  

  结论本研究中,ECFCs在体外连续传代培养时,细胞形态稳定,表型及功能未发生明显变化,且ECFCs-CM中包含丰富的细胞因子,其中多种为促创面愈合因子,说明ECFCs是研究干/祖细胞旁分泌效应对创面愈合作用的理想细胞来源;ECFCs-CM可促进HUVECs和HDFs的增殖及迁移能力,并抑制它们在血清饥饿环境下的凋亡,且可促进HUVECs的成管能力,预示了其在创面愈合方面的潜在应用价值。


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