首页 >> 细胞百科知识 >>细胞与健康 >> 细胞中的表达及其对成骨细胞分化的作用
详细内容

细胞中的表达及其对成骨细胞分化的作用

  重组人成纤维细胞生长因子17在昆虫细胞中的表达及其对成骨细胞分化的作用

  

  成纤维细胞生长因子17(Fibroblast growth factor 17,FGF17)是在1998年被日本科学家Hoshikawa从鼠胚胎中分离出来的一种成纤维细胞生长因子,是蛋白类成纤维细胞生长因子家族成员之一,它与FGF8和FGF18组成同一亚家族称为FGF8亚家族。

  

  在胚胎发育期间,FGF17优先在脑组织中表达,特别是大脑和小脑皮层。

  

  对各个器官不同的发育过程发挥着至关重要的作用,同时对神经系统、骨骼、动脉的发育和肿瘤的发生发展也有着重要影响。

  

  这些研究表明FGF17是一个具有研究意义和临床价值的蛋白,如何获得高纯度和活性良好的FGF17蛋白,并开展其对MC3T3-E1小鼠前成骨细胞的活性研究是本文的主要内容。

  

  本论文研究内容如下:(1)采用密码子优化工具OPTIMWIZ优化得到具有昆虫偏好性密码子的人FGF17基因,运用限制性内切酶酶切,连接,感受态细胞转染和蓝白斑筛选等方法成功构建重组杆状病毒载体Bacmid-rhFGF17。

  

  (2)采用脂质体包被法将穿梭载体质粒Bacmid-rhFGF17转染入昆虫细胞Sf9中,为了获得较高纯度和浓度的蛋白,不断优化表达条件如侵染复数(Multiplicity of infection,MOI)和侵染时间(Time of infection,TOI),利用肝素亲和层析柱纯化rhFGF17蛋白。

  

  结果显示,杆状病毒Bacmid-rhFGF17侵染Sf9细胞后,出现细胞体积变大,破裂,颗粒物现象。

  

  最优化表达条件是MOI为8pfu/mL,TOI为72h,纯化时洗脱液NaCl浓度为1.0mol/L,纯化得到rhFGF17蛋白分子量约为22.6KDa,蛋白产量2.60mg/L。

  

  (3)采用MTT法检测不同表达系统表达获得的rhFGF17蛋白对NIH3T3细胞和MC3T3-E1前成骨细胞增殖活性作用;运用碱性磷酸酶定量法、碱性磷酸酶染色法、实时荧光定量PCR(RT-PCR)、茜素红染色和定量法检测rhFGF17蛋白对MC3T3-E1前成骨细胞分化作用;最后利用蛋白印迹法研究rhFGF17蛋白调控MC3T3-E1前成骨细胞分化所作用的信号通路。

  

  结果显示昆虫细胞-杆状病毒表达系统(Insect cells-baculovirus expression system,IC-BEVS)表达的rhFGF17蛋白比大肠杆菌表达系统(E.coli)表达的rhFGF17蛋白活性强,对NIH3T3细胞和MC3T3-E1前成骨细胞都有促增殖作用,但rhFGF17蛋白对MC3T3-E1前成骨细胞分化起抑制作用,主要是通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径,激活ERK和p38信号而发挥作用。


贵州泛特尔细胞
咨询热线: 400-048-9990  
邮       箱:1027014116@qq.com
咨询QQ: 1027014116   

手       机:15180725452
传       真:010-12345678
公司地址:贵州省贵阳市金阳高新产业园都匀路109号 
关注微信公众号!

Copyright2014-2025All rights reserved  版权所有   使用条款 | 隐私 | 商标与版权 | 网站地图