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免疫功能及其在小鼠抗瘤免疫应答的研究

  二甲双胍抑制G-MDSCs的免疫功能及其在小鼠抗瘤免疫应答的研究

  

  目的:二甲双胍(metformin)体外处理小鼠粒细胞样髓源抑制性细胞(granulocytic myeloid-derived suppressor cells,G-MDSCs),观察 G-MDSCs 免疫抑制功能的变化,检测G-MDSCs相关效应分子的表达变化,并探讨可能的作用机制;在CT-26荷瘤小鼠体内,研究二甲双胍是否能够通过调控G-MDSCs的功能影响肿瘤的生长。

  

  方法:(1)使用皮下注射CT-26细胞的方式构建结肠癌荷瘤小鼠模型,采取MACS分离荷瘤小鼠脾脏中的G-MDSCs。

  

  经二甲双胍作用后,使用Western-blot技术检测STAT3磷酸化的表达水平;利用CFSE检测G-MDSCs对CD4+T细胞的免疫抑制功能的变化;流式细胞术(FCM)检测G-MDSCs中的活性氧(reactive oxygen specise,ROS)的表达情况;精氨酸酶(ARG-1)试剂盒检测ARG-1活性。

  

  (2)将分离得到的G-MDSCs在体外经二甲双胍刺激后,通过Western-blot检测G-MDSCs中AMPK的磷酸化水平。

  

  利用AMPK抑制剂(Compund C)抑制G-MDSCs中AMPK分子的磷酸化,再经二甲双胍作用,Western-blot检测细胞中AMPK以及STAT3分子的磷酸化;CFSE检测G-MDSCs的免疫抑制功能;FCM检测G-MDSCs中的ROS的表达情况;精氨酸酶(ARG-1)试剂盒检测ARG-1活性。

  

  (3)对荷瘤小鼠进行腹腔注射二甲双胍。

  

  观察小鼠皮下肿瘤的生长情况,观察肿瘤大小并测量其体积;FCM检测总MDSCs、G-MDSCs、CTLs、Th1及Treg细胞的比例。

  

  (4)分离经二甲双胍处理的荷瘤小鼠脾脏G-MDSCs,CFSE检测G-MDSCs的免疫抑制功能;FCM检测G-MDSCs中的ROS的表达情况;精氨酸酶(ARG-1)试剂盒检测ARG-1活性;运用Western-blot技术检测G-MDSCs中STAT3分子的磷酸化水平。

  

  结果:(1)从荷瘤小鼠脾脏中分选出的G-MDSCs经二甲双胍处理后,结果显示二甲双胍能够下调其STAT3磷酸化水平(P<0.05);二甲双胍明显减弱G-MDSCs对CD4+T细胞的免疫抑制功能(P<0.01)并显著抑制G-MDSCs精氨酸酶活性以及ROS表达水平(P<0.05)。

  

  (2)G-MDSCs经二甲双胍处理后AMPK磷酸化水平明显上调(P<0.05)。

  

  在G-MDSCs培养体系中加入Comound C预处理,再加入二甲双胍处理后,G-MDSCs中AMPK的磷酸化水平与对照组相比明显下调(P<0.05),但STAT3的磷酸化水平显著上调(P<0.05);G-MDSCs对CD4+T细胞的免疫抑制功能与对照组相比显著增强(P<0.001);ROS表达水平较对照组明显升高(P<0.05);精氨酸酶活性则无明显变化。

  

  (3)与生理盐水对照组相比,二甲双胍处理组肿瘤生长速度减缓(P<0.01),肿瘤体积减小,肿瘤重量减轻(P<0.01);FCM结果显示:二甲双胍处理后,小鼠体内浸润的总 MDSCs(P<0.05)、G-MDSCs(P<0.01)、Tregs(P<0.001)的比例较对照组明显降低;CTLs、Th1较对照组显著升高(P<0.05)。

  

  (4)与生理盐水对照组相比,二甲双胍处理组小鼠脾脏G-MDSCs的免疫抑制功能明显下降(P<0.001);ROS表达水平明显下降(P<0.05);ARG-1活性显著降低(P<0.05,P<0.01);G-MDSCs中STAT3磷酸化水平明显下调(P<0.01)。

  

  结论:(1)二甲双胍在体外能够通过增强AMPK的磷酸化,抑制STAT3分子的磷酸化水平,从而下调G-MDSCs的免疫抑制功能。

  

  (2)在荷瘤小鼠体内,二甲双胍能通过下调G-MDSCs的免疫抑制功能从而延缓肿瘤的生长。