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脑出血对免疫系统的影响

  脑出血对免疫系统的影响

  

  研究背景及目的:卒中是危害健康的全球性重要疾病,在美国,其致死和致残率仍排在第四位,幸存的卒中患者中,大多数存在中至重度残疾,导致上千亿美元的损失。

  

  脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)占所有中风的10–15%,死亡率可以高达30-50%,74%的幸存者发病后12个月仍然存在功能依赖,但对于这样一种严重的疾病,目前尚没有有效的治疗策略,血肿清除治疗只能在超急性期,出血量较大的患者进行干预,受益的只有一小部分病人,而血肿周围水肿(perihematomal edema,PHE)的发展和对脑组织的继发损伤的治疗仍显得苍白无力。

  

  血肿引起的原发性损伤包括大脑细胞结构的物理破坏和占位效应的影响。

  

  占位效应引起颅内压力增高,进而引发脑血流下降甚至脑疝形成,导致血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)破坏,水肿形成,神经损伤。

  

  随后,随着出血性成分的释放,脑源性神经损伤的信号,对凝血和补体系统触发激活脑内炎症形成导致的继发性脑损伤。

  

  首先是小胶质细胞激活,其次是中性粒细胞,然后是单核细胞和淋巴细胞浸润,通过释放活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),炎性介质,和直接的细胞毒作用从而加剧血肿周围脑损伤。

  

  对BBB的破坏,促进白细胞的浸润,本身可引起炎症。

  

  作为一个结果,这有助于ICH后炎症级联反应和PHE的形成,加剧了占位效应的影响,并加速了细胞的死亡过程。

  

  在ICH后的第一个24小时后,PHE增加75%左右,峰值在5至6天,并持续到14天。

  

  PHE的程度被视为ICH结局的重要预测指标。

  

  在初步研究中,免疫调节剂可以减少PHE的进展,在血浆中降低基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)水平和改善ICH患者的临床结果。

  

  感染是中风后的一个重要的临床并发症,增加残疾率和死亡率。

  

  尽管考虑较差的Glasgowcoma量表(Glasgowcoma scale,GCS)评分、插管、吞咽困难、侵入性操作可能与此相关,ICH后感染的机制尚不清楚。

  

  在动物模型的研究中显示,ICH似乎损害外周细胞免疫。

  

  尽管有上述背景,ICH对免疫系统的影响,潜在的机制及其与患者预后的关系仍不清楚。

  

  因此,我们试图探讨ICH患者出血后免疫系统器官和细胞水平的改变,并确定引起这种变化的神经通路。

  

  使免疫介导的炎症反应有可能成为治疗新的靶点。

  

  脾是机体最大的次级免疫器官,其体积变化是其功能以及整个机体免疫环境改变的重要信号,不同免疫细胞群体在ICH后的变化是了解外周免疫变化的重要途径,目前对于运用磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)的不同序列来了解ICH后脾体积及功能变化的研究未见报道,通过对ICH患者脾脏和外周血免疫细胞变化的研究,了解ICH后外周免疫状态的研究亦未见报道,我们的研究期望为ICH后免疫功能变化提供直接证据,为ICH后免疫系统机制的研究铺垫道路,以期对ICH后开发有效的免疫调节治疗提供理论依据。

  

  研究方法:1.ICH的参与者:选取≥18岁男性和非妊娠女性原发性基底节区出血的患者35例,出血量5-40ml经计算机断层扫描(head computed tomographic,CT)证实,发病后24小时以内入院,GCS评分≥6分。

  

  排除GCS评分3~5分的患者,具有外科手术指征的患者,住院前2周内有感染的患者,也排除了血肿扩大,继发性ICH患者,同时使用抗肿瘤,免疫抑制或免疫调节治疗的患者。

  

  20例健康对照组按年龄、性别和体重指数相匹配。

  

  2.头和脾脏MRI检查:所有患者于症状发作后第3天和第14天行头部和脾脏MRI检查,头部MRI进行轴位T2/T1/FLAIR/DWI扫描,明确出血位置及评估出血量及PHE情况。

  

  脾脏轴位T2扫描序列测量脾脏体积,多B值DWI扫描测量脾脏D值、D*值。

  

  正常对照组进行脾脏轴位T2扫描测量脾脏体积,多B值DWI扫描测量脾脏D值、D*值。

  

  出血体积和PHE是由大脑FLAIR序列图像量化。

  

  研究方案经天津市第三中心医院伦理委员会批准。

  

  并获得每个患者的知情同意。

  

  3.外周血循环中淋巴细胞及其亚群检测:所有受试者和健康对照组均进行了新鲜全血淋巴细胞及其亚群分析。

  

  分离单个核细胞进行荧光标记抗体的免疫染色。

  

  荧光标记抗体包括:CD3-PerCP,CD4-FITC,CD8-PE,CD19-PE,CD56-APC,CD11b-PerCP,CD11c-APC。

  

  数据通过应用FACSCalibur流式细胞仪进行数据提取,然后应用Flowjo 7.6.1软件对数据进行分析。

  

  4.神经递质和激素的测定:采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)并按制造商的说明书对血浆中的神经递质乙酰胆碱和去甲肾上腺素和糖皮质激素皮质醇进行测定。

  

  在450纳米和570纳米进行光学密度测定。

  

  5.建立实验性ICH小鼠模型:成年雄性C57BL/6小鼠(10~12周龄)被用于动物实验。

  

  对胶原酶诱导ICH模型,在小鼠脑内右侧基底节部位,注射胶原酶。

  

  为在体内诱导不同体积的ICH量,使用不同剂量的胶原酶。

  

  对于自体血注射的小鼠模型,利用30μl自体血注射在小鼠脑内右侧基底节区。

  

  6.ICH小鼠检测指标:在不同时间点处死后立即脾脏称重,并进行病理染色。

  

  0.0375u胶原酶注射诱导小鼠模型建立3天后处死;快速移出脾脏并于4%多聚甲醛固定后,用30%蔗糖脱水直到组织沉淀在底部。

  

  在最佳切削温度复合孵化,制成8μm厚的组织切片,每个组织切片进行HE染色,测量脾脏的白髓与红髓区面积,图片由荧光显微镜获得,应用Pro Plus图片处理系统进行分析。

  

  7.小鼠的神经通路阻断实验:阻滞剂包括:RU486溶解在乙醇(1:10,6 mg/ml),造模成功后以30 mg/kg的剂量腹腔注射,普萘洛尔溶解在生理盐水配制成6 mg/ml的溶液,造模成功后以60 mg/kg的剂量腹腔注射,二氢-β-刺桐定(DHβE)溶解在生理盐水配制成0.1 mg/ml的溶液,造模成功后以1mg/kg的剂量腹腔注射。

  

  根据不同的阻断记录脾脏收缩的情况。

  

  8.统计学分析:统计分析采用SPSS 17版软件进行(SPSS,公司,芝加哥,IL,美国)。

  

  计量资料的结果用均值±标准差表示,计数资料的结果用率表示。

  

  计量资料两组间的比较,符合参数检验的数据使用t检验,否则采用非参数检验方法(Mann-Whitney检验)。

  

  计量资料三组及三组以上间的比较采用单因素方差分析(ANOVA),两组间重复测量数据的比较采用双因素方差分析。

  

  计数资料的比较采用卡方检验。

  

  脾的变化和淋巴细胞数的之间的相关性采用Spearman相关分析。

  

  P<0.05被认为差异有统计学意义。

  

  研究结果:1.入院时ICH患者的特点:本研究共纳入从2015八月至2016五月35例ICH患者。

  

  没有死亡病例,没有脱落和失访病例。

  

  从发病到入院的平均时间为11.7±8.5小时。

  

  入选患者的平均年龄为62.1±11.8岁,男:女比例为27:8。

  

  20例健康对照组平均年龄59.1±9.8岁,男:女比例为15:5。

  

  ICH和健康对照组的年龄、性别和体重指数(BMI)差异无统计学意义。

  

  2.ICH后出现脾脏收缩,脾脏毛细血管灌注增加,脾脏细胞组织活性无改变:ICH患者的脾脏体积在发病后3天均小于发病后14天;事实上在14天,其脾脏体积与对照组的大小类似。

  

  在我们的研究中,脾体积在第3天和第14天相比,平均收缩了37cm3,,平均减少17.2%。

  

  磁共振体素内非相干性运动-弥散加权成像(Intravoxel incoherent motiondiffusion-weighted imaging,IVIM-DWI)MRI检测序列中,患者第3天的D*值显著高于第14天(P<0.001),第14天的D*值与健康对照组比较其差异没有统计学意义。

  

  患者第3天的D值与第14天相比较是稳定的,而且与健康对照组相比较其差异也没有统计学意义。

  

  3.脾脏收缩可以由入院时血肿大小预测,并与PHE和ICH预后相关:将ICH患者分为两组:重度脾收缩>37cm3(n=16)组或轻度脾收缩<37cm3(n=19)组。

  

  在重度脾收缩组患者入院的平均出血量大于轻度脾收缩组患者的出血量(12.9±10.5 vs 8.2±6.5毫升,P<0.05)。

  

  此外,我们发现在入院时出血量(小于24小时)与ICH 3天后脾脏收缩呈正相关(r=0.48,P<0.01)。

  

  轻度脾收缩组患者在ICH后最初的3天PHE迅速扩大,这种趋势持续至14天。

  

  与此相反,严重脾收缩组患者在ICH后最初的3天PHE进展温和,且水平在随后的11天基本上保持不变。

  

  定量分析,严重脾收缩组患者与轻度脾收缩组患者相比,在ICH后的3天和14天相对PHE(relative PHE,rPHE),严重脾收缩组患者比轻度脾收缩组患者较小(2.8±1.5 vs 4.5±1.5,P<0.001;3.2±1.5vs 5.8±2.5,P<0.01)。

  

  严重脾收缩组患者与轻度脾收缩组患者相比,从入院到90天NIHSS评分两组间差异没有统计学意义。

  

  在从入院到90天患者的NIHSS评分下降的分数严重脾收缩组患者比轻度脾收缩组患者多(P<0.05)。

  

  然而,改良Rankin量表(Rankin Scale,MRS)0–1分的患者在90天两组之间没有达到显著性差异。

  

  4.ICH后T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的细胞缺陷,与ICH后感染的增加和不良结局的易感性相关:淋巴细胞和CD4+T、NK、B细胞,和CD11c+细胞在ICH发病后减少。

  

  除了一个亚群,这些细胞在ICH后3天达到最低点,并持续在低水平直到14天。

  

  虽然CD8+T细胞亚群在ICH后显示出同样的负面趋势,但其差异无统计学意义。

  

  此外,CD4+T细胞和B细胞在ICH后3天的计数入院时血肿体积呈负相关(图3B),但总淋巴细胞和其他细胞亚群没有显示这种关联。

  

  ICH患者无论是淋巴细胞全细胞谱还是亚群细胞数在脾脏收缩>37cm3和脾脏收缩<37cm3的两组患者间的差异均无统计学意义。

  

  在这35名受试者中,有12人(34%)在住院期间遭受感染,入院时,继发感染患者的血肿大小似乎大于非感染患者;然而,这种差异没有达到统计学意义(13.5±9.5 vs 8.7±6.7 cm3,P>0.05)。

  

  无感染的患者中,70%的患者有较好的预后,被感染的患者只有8%有较好的预后,两组间差异有统计学意义(P<0.0001)。

  

  此外,CD4+T、CD8+T、NK细胞计数感染患者组比没有感染患者组显著降低,从第1天到第14天。

  

  5.实验性ICH小鼠模型中,下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的激活和交感神经的协同作用可能介导了ICH后的脾脏反应:在两种ICH实验性小鼠的模型中,均出现了显著的脾脏缩小的变化,与ICH患者的临床结果相一致。

  

  ICH后的脾脏收缩与不同的血肿体积呈正相关。

  

  HE染色观察小鼠脾脏变化,发现ICH后脾脏毛细血管的灌注增加,小鼠白髓区减少,(P<0.05)。

  

  我们用β-肾上腺素能受体阻滞剂,普萘洛尔,对肾上腺素能阻滞,糖皮质激素受体拮抗剂RU486,α4β2胆碱能阻滞剂DHβE对胆碱能阻断。

  

  我们的研究结果表明,DHβE未能抑制脾收缩,但普萘洛尔和RU486可部分抑制ICH小鼠的脾脏收缩。

  

  此外,神经递质检测表明,ICH患者较健康对照组血浆中的乙酰胆碱水平较低,从第3天到第14天,并保持稳定,从第3天和14天在ICH患者血清中去甲肾上腺素和皮质醇的浓度较高。

  

  结论:1.脑出血后3天,脾脏体积减少、脾的毛细血管血流灌注增加,但不伴有脾细胞活性变化。

  

  2.脾体积的减少程度与入院时血肿体积的大小呈正相关关系,与PHE进展相关,与神经系统修复相关。

  

  3.ICH后患者免疫细胞的功能缺陷和感染易感性增加以及不良结局的发生相关。

  

  4.下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的激活和交感神经的协同作用可能介导了ICH后的脾脏反应。

  

  5.脾萎缩和淋巴细胞减少,反映出ICH后在器官和细胞水平对免疫系统的影响的两个方面,源自交感神经和HPA轴的协同作用。