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cGAS信号通路介导牛分枝杆菌激活小鼠髓源树突状细胞免疫应答的研究

  

  

  牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M bovis)是一种导致牛结核病的典型胞内病原菌,可跨物种传播给人和其他哺乳动物。

  

  在全球造成了重大的经济损失,并威及社会公共卫生安全。

  

  近期,美籍华人科学家陈志坚教授课题组发现了一种新型的DNA识别分子,环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS),cGAS属于核苷酸转移酶成员,可特异性识别细胞质中的双链DNA,催化合成cGAMP,进而依赖STING介导的信号通路诱导Ⅰ型干扰素的产生。

  

  长期以来的研究都将巨噬细胞作为结核菌感染的主要宿主细胞,但随着树突状细胞生理功能的逐步明了,其在结核菌感染中的作用越来越受到人们的重视。

  

  本实验旨在探究小鼠髓源树突状细胞(murine bone marrow derived dendritic cell,BMDC)感染牛分枝杆菌后,cGAS 信号通路的表达,以及对BMDC成熟及活化的调控,进一步探究感染后CD4+T细胞的免疫应答,阐明相关作用机制。

  

  1.利用体外诱导的方法,原代分离BMDC,且纯度达到90%以上。

  

  通过Western blot检测感染后BMDC中cGAS及其下游相关蛋白的表达情况,利用免疫荧光显微镜观察IRF3的入核现象。

  

  结果显示,感染后cGAS、p-TBK1的蛋白表达量上升,STING表现出双条带,IRF3入核现象明显。

  

  而利用siRNA沉默cGAS后,下游相关蛋白表达均受到抑制,IRF3入核现象减弱。

  

  2.利用流式细胞术以及Ⅰ型干扰素受体阻断剂,检测感染后BMDC表面标志物CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ的表达情况,利用ELISA试剂盒检测细胞上清中IFN-β、IL-12p70、IL-10、IL-6、TNF-α的分泌情况。

  

  结果显示,感染后表面标志物表达量显著上升,而cGAS沉默后以及Ⅰ型干扰素受体阻断后,表达量均受到抑制。

  

  细胞因子的变化趋势基本与之相同,但TNF-α不受阻断剂的影响。

  

  添加外源性IFN-β后TNF-α、IL-12p70分泌量上调,而IL-10、IL-6则无明显变化。

  

  3.利用免疫磁珠方法从小鼠的脾脏特异性分离出CD4+T细胞,添加示踪性荧光标签后,建立BMDC与CD4+T细胞共培养体系,通过流式细胞术和ELISA技术分别检测CD4+T细胞的增殖情况以及IFN-γ的分泌。

  

  结果显示,感染组可显著诱导CD4+T细胞的增殖,而阻断Ⅰ型干扰素受体后扩增能力下降。

  

  感染后IFN-γ表达量显著上调,而在阻断组中则受到明显抑制。

  

  综上所述,本研究表明,cGAS信号通路存在于BMDC中,感染牛分枝杆菌后cGAS及下游相关蛋白可被激活,并且cGAS信号通路以及Ⅰ型干扰素途径有助于BMDC表型的成熟和功能的活化,对抗原呈递起到促进作用。

  

  此外牛分枝杆菌感染BMDC后,可显著增强CD4+T细胞的扩增能力,提高IFN-γ的分泌量,诱发获得性免疫应答。


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