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调节性自然杀伤细胞在重型再生障碍性贫血免疫发病机制中的作用研究

  

  

  目的分析重型再生障碍性贫血(Severe aplastic anemia,SAA)患者调节性自然杀伤细胞(CD56bright Natural Killer cells,CD56bright NK cells)数量、表面受体及产生细胞因子的水平;体外分离NK细胞,验证SAA患者NK细胞产生特定细胞因子的信号通路激活状态;探索SAA患者NK细胞对其他免疫细胞分化、增殖与功能的影响,揭示调节性NK细胞在SAA免疫发病机制中的作用,为细胞免疫治疗提供理论依据。

  

  方法连续收集自2015年1月至2016年12月在天津医科大学总医院血液内科住院治疗的SAA初治患者21例、治疗后缓解患者21例为实验组实验对象,健康志愿者22例为正常对照。

  

  第一部分采用流式细胞术检测SAA初治患者、SAA恢复期患者(SAA response to immunosuppressive therapy,SAA-CR+PR)和正常对照者(Healthy Controls,HC)外周血NK细胞亚群(CD56bright NK细胞和CD56d im NK细胞)数量并与患者临床指标做相关性分析。

  

  流式细胞术检测NK细胞亚群表面激活性受体NKp46、NKp44、NKG2D,抑制性受体NKG2A、CD158a、CD158b,胞内蛋白穿孔素、颗粒酶B,粘附分子DNAM-1,胞内产生细胞因子IFN-γ、IL-17a、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β的表达情况。

  

  检测SAA患者外周血血浆IL-2和IL-12水平,分选正常对照者CD56bright NK细胞,以rh IL-2和rh IL-12体外刺激培养,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测不同时间段IFN-γ和IL-10 m RNA表达。

  

  第二部分免疫磁珠分选初治SAA、缓解期SAA和正常对照者NK细胞,应用rh IL-2和rh IL-12体外刺激培养,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测NK细胞上清IFN-γ、IL-10和TGF-β水平,q RT-PCR检测IFN-γ、IL-10、TGF-β、STAT4、p38、STAT6 m RNA的表达,蛋白质印迹法(Western Blot)检测NK细胞STAT4、p-STAT4、p38、p-p38的表达。

  

  第三部分免疫磁珠分选SAA和正常对照者NK细胞,分别与SAA患者免疫磁珠分选且体外激活的CD4+T细胞、CD8+T细胞和诱导分选的髓样树突状细胞(myeloid Dendritic Cells,m DC)共培养,流式细胞术检测NK细胞经自体CD4+T细胞刺激前后脱颗粒水平、CD4+T细胞共培养前后Th1、Th2、Th17、调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)数量、CD8+T细胞胞内细胞毒性颗粒(穿孔素和颗粒酶B)的表达、m DC表面共刺激分子CD86、CD80表达,CCK-8检测CD8+T细胞和m DC增殖活性,q RT-PCR检测CD4+T细胞转录因子T-bet、GATA3、RORγt和FOXP3 m RNA的表达。

  

  结果第一部分初治SAA患者CD56bright NK/NK百分比为(4.33±2.53)%,较HC组(7.46±2.53)%显著降低(p=0.001),而初治SAA患者CD56dim NK/NK百分比(95.67±2.54)%与正常对照者未见明显差异;初治SAA患者CD56brightNK绝对值为(3.26±2.85)×106/L,较HC组(10.94±5.34)×106/L明显降低(p<0.01),CD56brightNK绝对值随SAA病情缓解而上升为(10.13±6.81)×106/L(p<0.01)。

  

  初治SAA患者CD56bright NK细胞绝对值与血小板(PLT)绝对值(R=0.735,p<0.01)、网织红细胞(Ret)绝对值(R=0.755,p<0.01)、Ret百分比(R=0.670,p<0.01)呈正相关。

  

  初治SAA患者CD56brightNK细胞NKp46阳性率(99.61±0.61)%及平均荧光强度(MFI)(361.56±70.71)均高于HC阳性率(81.27±7.09)%及MFI(118.58±48.76)(p<0.01)。

  

  初治SAA患者CD56brightNK细胞NKp44阳性率(13.37±6.65)%及MFI(14.17±4.43)明显高于正常对照者阳性率(3.55±3.32)%及MFI(5.91±2.12)(p<0.01)。

  

  SAA初治患者CD56bright NK细胞NKG2D之MFI(216.82±50.07)明显高于HC(126.42±37.84)(p<0.01)。

  

  初治SAA患者CD56brightNK细胞NKG2A阳性率(63.49±23.66)%较HC(83.09±14.83)%明显降低(p=0.006)。

  

  初治SAA患者CD56brightNK细胞表达极低的CD158a和CD158b,与HC比较没有统计学差异。

  

  初治SAA患者产生穿孔素、颗粒酶B的CD56brightNK细胞百分比与缓解期SAA、正常对照者无明显差异。

  

  初治SAA患者(96.68±1.73)%的CD56bright NK细胞呈现DNAM-1+,高于HC(94.49±2.15)%(p=0.020)。

  

  PMA刺激后,初治SAA患者产生IFN-γ的CD56bright NK细胞为(17.0±4.1)%,较正常对照者(23.2±6.4)%明显减低(p=0.010)。

  

  初治SAA患者产生IL-10的CD56brightNK细胞百分比为(5.19±2.60)%高于缓解期SAA(3.42±1.14)%(p=0.031)及对照(2.36±0.58)%(p<0.01)。

  

  初治SAA患者产生IL-4的CD56brightNK细胞占(0.95±0.42)%,高于缓解期SAA(0.56±0.25)%(p=0.002)及对照(0.34±0.22)%(p<0.01)。

  

  初治SAA患者的CD56brightNK细胞产生TGF-β的百分比为(5.57±2.43)%,高于缓解期SAA(3.94±0.81)%(p=0.040)及对照(3.19±0.48)%(p=0.002)。

  

  SAA患者CD56b rightNK产生IL-17a、TNF-α、IL-13的水平与对照无差异。

  

  初治SAA患者血浆IL-2、IL-12浓度分别为(156.3±23.5)和(28.9±6.1)pg/m L,明显高于缓解期SAA(IL-2:(112.6±27.3)pg/m L、IL-12:(22.4±7.9)pg/m L)(p<0.01),及对照(IL-2:(30.0±8.6)pg/m L、IL-12:(20.4±5.1)pg/m L)(p<0.01)。

  

  免疫磁珠分选的健康对照者的CD56bright NK细胞纯度大于70%。

  

  对照者的CD56bright NK细胞IFN-γm RNA相对表达量在rh IL-2和rh IL-12刺激3天时明显升高(1.44±0.13)(p=0.009),刺激7天时明显下降(0.79±0.12)(p=0.002)。

  

  对照者的CD56bright NK细胞IL-10 m RNA相对表达量在rh IL-2和rh IL-12刺激3天时未见明显变化(1.24±0.54),刺激7天时出现升高(2.67±1.29)(p=0.026)。

  

  第二部分分选NK细胞纯度大于95%。

  

  初治SAA患者NK细胞分泌IFN-γ为(95.6±36.1)pg/m L,较缓解期SAA(100.4±38.5)pg/m L及对照(105.3±54.4)pg/m L有下降趋势,但无统计学差异。

  

  初治SAA患者NK细胞IFN-γm RNA相对表达量为(0.09±0.05)明显低于缓解期SAA(0.67±0.32)(p<0.01)及对照(1.04±0.32)(p<0.01)。

  

  初治SAA患者NK细胞STAT4 m RNA相对表达量(中位数为0.25(0.01,1.53))明显低于正常对照者(中位数0.93(0.18,4.92))(p=0.001)。

  

  Western Blot检测初治SAA患者NK细胞STAT4激活率(p-STAT4/STAT4)为(0.76±0.09),低于缓解期SAA患者(0.87±0.09)(p=0.020)和正常对照者(0.95±0.10)(p<0.01)。

  

  初治SAA患者NK细胞分泌IL-10水平(16.5±6.9)高于缓解期SAA(11.0±7.5)(p=0.012)及正常对照者(9.3±6.6)(p=0.005)。

  

  初治SAA患者NK细胞IL-10 m RNA相对表达量为(4.01±2.37)高于缓解期SAA(2.84±2.95)(p=0.030)及正常对照者(1.75±1.79)(p<0.01)。

  

  初治SAA患者NK细胞p38 m RNA相对表达量(2.25±1.26)高于正常对照者(1.51±1.32)(p=0.038)。

  

  初治SAA患者NK细胞p38激活率(p-p38/p38)为(1.08±0.22),高于缓解期SAA患者(0.83±0.16)(p=0.003)和正常对照者(0.64±0.13)(p<0.01)。

  

  初治SAA患者NK细胞STAT6 m RNA相对表达量(中位数3.41(0.33,10.41))高于对照者(中位数1.36(0.27,4.08))(p=0.001)。

  

  初治SAA患者NK细胞分泌TGF-β水平(93.2±39.0)高于对照者(61.4±17.5)(p=0.009)。

  

  初治SAA患者NK细胞TGF-βm RNA相对表达量为(3.45±2.37)高于对照者(1.60±1.48)(p=0.007)。

  

  第三部分分选NK、CD4+T、CD8+T细胞纯度均大于95%。

  

  诱导分选m DC细胞纯度大于70%。

  

  当经rh IL-2培养刺激的NK细胞与自体激活的CD4+T细胞共培养后,初治SAA患者CD107a+NK细胞百分比(28.68±12.44)%明显较对照者升高(17.05±9.04)%(p=0.017)。

  

  初治SAA患者Th1细胞数量及Th1/Th2比例较对照者明显升高。

  

  与初治SAA患者NK细胞共培养后,CD4+T细胞中Th1细胞数量减少、T-bet m RNA相对表达量(0.99±0.54)降低,Th2细胞数量增多、GATA3 m RNA相对表达量(1.94±0.96)增多,Th1/Th2比例下降。

  

  初治SAA患者Th17细胞数量升高、Treg数量下降、Th17/Treg比例升高。

  

  初治SAA患者CD4+T细胞与SAA来源的NK细胞共培养后,Th17细胞数量减少、RORγt m RNA相对表达量(0.55±0.40)降低,Treg细胞数量升高、FOXP3 m RNA相对表达量(2.00±0.91)升高,Th17/Treg比例下降。

  

  与初治SAA患者NK细胞共培养(+SAA NK)的CD8+T细胞增殖抑制率(4.50±1.79)%与HC的NK细胞共培养(+HC NK)抑制率(3.44±1.31)%无明显差异。

  

  但+HC NK组CD8+T细胞穿孔素和颗粒酶B表达率(分别为(29.70±6.18)%和(45.26±9.01)%)较无NK共培养组(Ctrl)(分别为(24.75±5.50)%和(35.29±7.41)%)升高(p<0.05),而+SAA NK组未使CD8+T细胞胞内穿孔素和颗粒酶B表达升高。

  

  +SAA NK组m DC细胞增殖抑制率(5.55±1.65)%高于+HC NK组抑制率(4.31±1.60)%(p=0.047)。

  

  +HC NK组m DC细胞CD80表达率(89.16±6.77)%较+SAA NK组(83.75±6.59)升高(p=0.037),各组间CD86表达没有差异。

  

  结论1、SAA患者CD56bright NK细胞数量显著减少,且与患者多项外周血细胞数指标呈正相关,即CD56bright NK细胞数量越少,病情越重,经强化免疫抑制治疗(IST)后CD56bright NK细胞数量有所改善。

  

  2、SAA患者CD56bright NK细胞激活性受体升高,抑制性受体降低,细胞处于激活状态;粘附分子表达DNAM-1增强,可能具有更强的迁移能力,穿孔素和颗粒酶B产生较少,细胞毒性作用不明显,产生Ⅰ型细胞因子(IFN-γ)减少,Ⅱ型细胞因子(IL-10、TGF-β)增多,可能起到调节SAA疾病状态的作用。

  

  3、SAA患者外周血血浆IL-2和IL-12浓度升高。

  

  正常对照者CD56bright NK细胞在rh IL-2和rh IL-12刺激下呈现随时间依赖性IFN-γ先升高后降低,IL-10随时间升高,与IL-2的自调节作用可能相关。

  

  4、SAA患者NK细胞在rh IL-2和rh IL-12体外刺激下,JAK-STAT4—IFN-γ信号通路下调,而p38 MAPK—IL10、TGF-β信号通路上调,从而产生IFN-γ水平下降,IL10水平升高,IL-10的产生升高可能也与JAK-STAT6上调有关。

  

  5、SAA患者Th1/Th2和Th17/Treg升高。

  

  SAA患者CD4+T细胞体外在与SAA患者NK细胞共培养后,Th1/Th2和Th17/Treg比例下调,即SAA患者NK细胞可参与调控CD4+T细胞分化以改善疾病情况的失平衡状态。

  

  6、SAA患者NK细胞体外对CD8+T细胞增殖抑制没有明显作用,但较HC来源NK细胞可对CD8+T细胞胞内穿孔素和颗粒酶B的产生具有一定下调作用,抑制CD8+T细胞的活化,改善SAA机体T细胞功能亢进状态。

  

  7、SAA患者NK细胞体外对m DC细胞增殖具有抑制作用。

  

  且对m DC细胞表面共刺激分子CD80表达具有一定下调作用,继而减弱其抗原提呈能力,减弱T细胞激活。


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