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烫伤后TNF-α诱导蛋白-8样分子2介导树突状细胞免疫功能障碍及其机制

  

  

  研究背景和目的:肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8样分子2(tumor necrosis factor-αinduced protein 8 like-2, TIPE2)在机体免疫细胞内存在表达,可能参与烧伤后脓毒症的病理生理过程。

  

  但TIPE2表达是否影响树突状细胞(dendritic cells, DC)的免疫功能迄今尚不清楚。

  

  实验方法:1.采用免疫磁珠法分离正常BALB/c小鼠脾脏DC。

  

  采用激光共聚焦技术精确定位DC细胞内TIPE2的表达;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测TIPE2在DC细胞中的基因和蛋白表达水平。

  

  体外实验部分将携带TIPE2 siRNA/TIPE2 RNA的慢病毒载体转染至DC细胞,抑制/上调DC细胞内TIPE2基因/蛋白的表达;体内实验部分通过尾静脉注射携带TIPE2 siRNA/TIPE2 RNA的慢病毒载体,饲养两周待表达稳定后,复制小鼠重度烫伤模型。

  

  DC细胞表面抗原、共刺激分子和抗原呈递分子采用流式细胞术检测;DC对T淋巴细胞增殖反应的影响应用CCK-8法检测;DC自身分泌的细胞因子、DC/T共培养上清液中细胞因子水平的变化及T淋巴细胞核内活化T细胞的核因子(nuclear factor of activated T cells,NF-AT)活性采用ELISA检测。

  

  统计学方法:计量资料用x±s表示,采用SPSS 17.0统计软件分析各组数据,俩样本间比较采用t检验,单因素多组数据进行方差分析(One-WayANOVA)。

  

  以P<0.05代表差异有统计学意义。

  

  主要结果和结论:1.激光共聚焦显微镜成像分析显示TIPE2在DC胞浆中表达,TIPE2在DC内存在基因和蛋白表达。

  

  2.流式结果显示,CD80、CD86及主要组织相容性复合体-Ⅱ类分子(MHC-Ⅱ)表达在TIPE2沉默DC细胞组显著增强,TIPE2过表达组3种表面分子的表达均明显降低。

  

  小鼠烫伤24h后,siRNA-TIPE2转染组DC表面3种分子表达均较烫伤组出现显著上调,TIPE2 RNA转染组其表达则明显下调(P,0.01)。

  

  3. ELISA结果显示,siRNA-TIPE2转染组DC细胞上清液中检测到较高水平IL-12、TNF-α(P<0.01)。

  

  小鼠严重烫伤后,siRNA-TIPE2转染组IL-12、TNF-α生成量显著升高,而TIPE2RNA转染组两种细胞因子水平明显降低(P<0.01)。

  

  4. CCK8法检测显示,沉默TIPE2表达后T细胞增殖活性较正常组增强。

  

  小鼠烫伤24h后,siRNA-TIPE2转染组T细胞增殖活性明显增强,TIPE2上调组T细胞增殖活性则显著减弱(P<0.01)。

  

  5. TIPE2-RNA转染DC细胞后,IL-2水平及T细胞NF-AT活性显著降低。

  

  烫伤24 h后TIPE2 RNA转染组IL-2水平及T细胞NF-AT活性较烫伤组明显降低,TIPE2 siRNA转染组IL-2生成量及T细胞NF-AT活性显著升高(P<0.01)。

  

  6. TIPE2 siRNA转染DC细胞后,IFN-γ生成量增加,IL-4生成量下降,T细胞向辅助性T细胞(Th) 1方向极化。

  

  与烫伤组相比,TIPE2 RNA转染组IFN-γ水平降低而IL-4含量升高,TIPE2siRNA转染组,IFN-y水平上升而IL-4含量显著降低(P<0.01)。

  

  上述结果提示,TIPE2可显著影响严重烫伤小鼠DC细胞的分化成熟及其介导的T淋巴细胞功能。


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