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他克莫司对实验性自身免疫性肌炎小鼠中CD4+T淋巴细胞亚群的影响

  

  

  特发性炎症性肌病(idiopathic inflammatory myopathies,IIMs)是一组以骨骼肌炎性细胞浸润、肌无力、肌疲劳为特征的一组疾病,根据不同的临床和病理学特征,可以分为以下几类:多发性肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎、坏死性肌炎。

  

  免疫细胞介导的肌纤维损伤、肌炎特异性和肌炎相关抗体的存在及骨骼肌MHC-Ⅰ分子的过表达充分说明该疾病是一种免疫介导的疾病。

  

  免疫组织化学研究表明,患者肌肉组织有大量炎性细胞浸润,主要为巨噬细胞和CD8+、CD4+T细胞。

  

  Th1和Th17细胞是CD4+T细胞的亚群,二者在多发性硬化、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病发生发展中有关键作用。

  

  肌炎患者血清TNF、IFN-γ、IL-12的升高提示Th1介导了该类疾病的发生。

  

  最近研究描述了Th17相关因子如IL-17、IL-22、IL-6在肌炎患者的过度表达,突出了Th17在肌炎发病中的作用。

  

  Treg细胞是具有免疫抑制功能的、CD4+T细胞的另一个亚群,是维持机体免疫稳态和免疫耐受的重要细胞。

  

  一般情况下,三者处于一种动态平衡。

  

  免疫稳态的打破,如Treg功能缺失,Th1、Th17等效应T细胞过度增殖,常导致炎症和多种自身免疫性疾病的发生发展。

  

  目前IIMs确切病因及致病机制不明,临床上多采用糖皮质激素的对症治疗,长时间应用副作用大、效果并不理想。

  

  他克莫司(tacrolimus,Tac)是从链霉菌属中提取的大环内酯类化合物,是一种钙调磷酸酶抑制剂,通过抑制磷酸酶的活化下调IL-2水平,进而抑制T淋巴细胞的增殖。

  

  Tac作为一种新型强效免疫抑制剂,已被应用于类风湿性关节炎、炎症性肠病等自身免疫性疾病并显示出良好的治疗作用。

  

  那么,Tac对IIMs的作用及对肌炎中Th1、Th17、Treg细胞的影响如何,尚未有明确报道。

  

  本研究拟通过Tac干预实验性自身免疫性肌炎(experimental autoimmune myositis,EAM)小鼠,检测小鼠中Th1、Th17、Treg细胞及其相关细胞因子的变化,观察Tac对肌炎小鼠中三种CD4+T细胞亚群的影响,探讨Tac的可能治疗作用。

  

  目的:观察Tac对肌炎小鼠Th1细胞及IFN-γ、Th17细胞及IL-17A、Treg细胞及Foxp3的影响,评估Tac对EAM小鼠的治疗效果,为IIMs的治疗提供实验基础。

  

  方法:实验一Tac对EAM小鼠的治疗作用15只雌性BALB/c小鼠随机分为正常对照组、EAM模型组、Tac干预组。

  

  连续14天药物干预后,分别观察各组小鼠一般状态,测量各组小鼠肌力;HE染色观察三组小鼠肌纤维损伤及炎细胞浸润情况;RT-PCR检测肌肉组织IL-1β、IL-6、IL-23mRNA表达水平;液相芯片技术检测三组小鼠血清IL-1β、IL-6水平。

  

  实验二Tac对EAM小鼠Th1、Th17、Treg细胞的影响分离小鼠脾脏淋巴细胞,按106/ml接种于96孔培养板,分别给予不同浓度Tac干预,采用CCK8法检测Tac对脾细胞增殖的影响;PMA、Ionomycin刺激脾脏淋巴细胞活化,FACS检测CD4+T细胞表面CD25、CD69的表达,观察不同剂量Tac对CD4+T细胞活化的影响;FACS检测三组小鼠脾脏中Th1、Th17、Treg细胞的数量;RT-PCR检测小鼠脾脏IFN-γ、IL-17A、Foxp3 mRNA及IL-12、IL-23 mRNA表达水平;液相芯片技术检测三组小鼠血清IFN-γ、IL-17A水平。

  

  结果:实验一正常组小鼠肌力较好,时间都大于1800s,EAM组小鼠肌力大幅度下降,为150.2±17.31s,与EAM组相比,Tac干预组肌力明显回升,为245.8±14.02s(P<0.05);HE染色可见大量炎细胞浸润EAM小鼠肌肉组织,Tac干预组与EAM组相比,炎细胞明显减少;三组小鼠肌肉组织学评分分别为0、2.38±0.17、1.76±0.15(P<0.05 EAM组vs正常组;P<0.05 Tac组vs EAM组);三组小鼠肌肉组织IL-1β、IL-6、IL-23mRNA表达情况:与正常组小鼠相比,EAM小鼠肌肉组织IL-1β、IL-6、IL-23mRNA表达水平均显著升高(IL-1β:1.03±0.29 vs 3.18±0.41,IL-6:1.01±0.16 vs2.77±0.36,IL-23:1.02±0.23 vs 2.85±0.54),三者表达水平在Tac干预组小鼠有明显下降(分别为2.34±0.37、1.99±0.40、1.89±0.34),与EAM组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);正常组小鼠血清中IL-1β、IL-6水平较低,分别为4.64±1.68pg/ml,17.92±5.61pg/ml,EAM组可见有大幅度升高(IL-1β:34.54±4.10pg/ml,IL-6:170.71±21.93pg/ml),而Tac干预组二者浓度虽仍然比较高,但相比较EAM组,下降明显(IL-1β:23.89±5.14pg/ml,IL-6:77.51±14.03pg/ml),差异有统计学意义(P<0.05)。

  

  实验二Tac可明显抑制脾淋巴细胞增殖,且呈一定的剂量依赖性。

  

  Tac可显著减少CD4+T淋巴表面CD25、CD69表达:正常组、Tac干预组(低、中、高剂量组)CD4+T淋巴细胞CD25表达率分别为75.56±4.92%,22.83±4.13%,15.77±4.21%,10.63±2.77%;CD69表达率分别为73.92±4.33%,48.13±3.95%,43.44±2.66%,40.40±3.11%。

  

  与正常组相比,EAM组小鼠脾脏Th1、Th17、Treg细胞显著增多(Th1:0.97±0.33%vs3.24±1.39%,Th17:0.51±0.09%vs 1.47±0.47%,Treg:1.47±0.21%vs 3.27±0.90%),Tac干预组三者均有不同程度下降(Th1:1.52±0.24%,Th17:0.82±0.07%,Treg:1.87±0.15%),差异有统计学意义(P<0.05)。

  

  三组小鼠脾脏IFN-γ、IL-17A、Foxp3mRNA的变化趋势与各自的细胞一致:与正常组相比,EAM组显著升高,Tac干预组均有不同程度回落(IFN-γ:1.03±0.28,3.41±0.49,2.34±0.63;IL-17A:1.00±0.09,2.78±0.62,2.04±0.30;Foxp3:1.04±0.24,1.73±0.28,1.19±0.24)。

  

  正常组小鼠血清IFN-γ较低,为2.14±0.55pg/ml,EAM组小鼠该因子水平较正常组增长了10倍之多(23.56±5.22pg/ml),Tac干预组可见显著下降(16.10±3.16pg/ml)。

  

  血清IL-17A变化趋势同IFN-γ,EAM组最高,约为正常组的9倍,Tac组较EAM组明显下降(三组浓度分别为:10.77±4.27pg/ml,91.97±27.52pg/ml,43.37±16.81pg/ml)。

  

  与正常组相比,模型组小鼠脾脏IL-12、IL-23mRNA水平显著升高(IL-12:0.96±0.09 vs3.01±0.82,IL-23:1.06±0.19 vs 2.10±0.42),Tac干预后,二者均明显下调(分别为1.67±0.49,1.50±0.19),差异有统计学意义(P<0.05)。

  

  结论:1.Tac可改善肌炎小鼠肌力,减轻肌肉组织炎症。

  

  Tac干预后,肌炎小鼠肌肉组织炎性因子IL-1β、IL-6、IL-23 mRNA表达水平明显降低,血清IL-1β、IL-6水平也明显降低,提示Tac对EAM小鼠有明显的治疗效果。

  

  2.Tac对脾脏淋巴细胞增殖具有明显抑制作用,且呈一定的剂量依赖性;Tac对CD4+T淋巴细胞活化有明显抑制作用。

  

  3.Tac可降低EAM小鼠中Th1、Th17数量,但没有增加Treg细胞数量;Tac可下调肌炎小鼠中IL-12、IL-23 mRNA表达水平。

  

  综上提示,Tac可能通过影响IL-12/Th1、IL-23/Th17炎症轴,发挥对肌炎小鼠的保护作用。

  

  其具体机制尚需进一步验证。


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