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申克孢子丝菌酵母相诱导人THP-1巨噬细胞Dectin-1介导固有免疫应答

  申克孢子丝菌酵母相诱导人THP-1巨噬细胞Dectin-1介导固有免疫应答机制的初步研究

  

  第一章申克孢子丝菌酵母相诱发人THP-1巨噬细胞吞噬作用及释放活性氧的初步研究目的初步探索人THP-1巨噬细胞对申克孢子丝菌酵母相的吞噬效应及活性氧(reactive oxygen species,ROS)释放。

  

  方法人 THP-1 细胞经佛波酯(Propylene glycol monomethyl ether acetate,PMA)诱导分化形成巨噬细胞,与申克孢子丝菌酵母相共培养,荧光显微镜下观察THP-1巨噬细胞对申克孢子丝菌酵母相的吞噬现象,流式细胞术检测吞噬效应及ROS释放水平。

  

  结果人THP-1细胞经PMA诱导分化为成熟的巨噬细胞,附着于培养瓶,细胞形态呈多形性。

  

  与申克孢子丝菌酵母相共培养后THP-1巨噬细胞内出现申克孢子丝菌成分,随着共培养时间的延长,THP-1巨噬细胞吞噬率逐渐升高,细胞内ROS表达水平也明显升高。

  

  结论人THP-1巨噬细胞能够吞噬申克孢子丝菌酵母相,并增强细胞内ROS表达。

  

  第二章申克孢子丝菌酵母相诱导人THP-1巨噬细胞产生前炎症因子的初步研究目的探讨申克孢子丝菌酵母相对THP-1巨噬细胞肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素 6(Interleukin-6,IL-6)等前炎症因子分泌的影响。

  

  方法实时荧光定量PCR分析申克孢子丝菌酵母相刺激THP-1巨噬细胞后3、6 h的TNF-α及IL-6 mRNA表达水平变化,刺激后24 h采用酶联免疫吸附法检测TNF-α、IL-6分泌量。

  

  凝胶多糖(Curdlan)为阳性刺激物。

  

  结果共培养后3、6 h,申克孢子丝菌组、凝胶多糖组、空白对照组间TNF-α、IL-6 mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.001)。

  

  申克孢子丝菌酵母相刺激THP-1巨噬细胞后3、6 h,差异也有统计学意义(P<0.001),TNF-α、IL-6 mRNA水平均随着申克孢子丝菌酵母相刺激时间延长而升高。

  

  申克孢子丝菌酵母相刺激THP-1巨噬细胞后24 h,TNF-α蛋白水平为(4610.419 ± 121.501 pg/mL),显著高于空白对照组(186.964 ± 98.073 pg/mL),差异具有统计学意义(P<0.001);IL-6蛋白水平为(59.96± 18.16 pg/L),较空白对照组(5.50±2.30pg/L)明显升高,差异有统计学意义(P=0.004)。

  

  结论THP-1巨噬细胞与申克孢子丝菌酵母相作用后促进TNF-α、IL-6前炎症因子分泌,参与抗申克孢子丝菌感染的固有免疫反应。

  

  第三章申克孢子丝菌酵母相活化人THP-1巨噬细胞Dectin-1受体及其下游信号通路的初步研究目的研究申克孢子丝菌酵母相对人THP-1巨噬细胞表面Dectin-1受体表达水平及Dectin-1受体下游脾酪氨酸激酶(Syk)、核转录因子kappaB(NF-κB)、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路激活的影响。

  

  方法流式细胞术检测THP-1巨噬细胞与申克孢子丝菌酵母相作用后0、3、6、12和24 h胞膜表面Dectin-1受体的表达水平。

  

  Western印迹法分析申克孢子丝菌酵母相作用于THP-1巨噬细胞0、15、30、60、90、120 min后Syk、p38MAPK、IκBα磷酸化水平的变化,免疫荧光法观察NF-κB-p65核转位。

  

  结果申克孢子丝菌酵母相作用于THP-1巨噬细胞后3h,胞膜表面的Dectin-1受体表达量达最高峰,6、12和24 h组其表达量仍维持在较高水平。

  

  申克孢子丝菌酵母相作用于THP-1巨噬细胞后0、15、30、60、90、120 min,磷酸化Syk、磷酸化p38 MAPK、磷酸化IκBα蛋白水平明显升高,IκBα蛋白水平相应降低,为时间依赖性;Syk、p38MAPK蛋白水平无明显变化。

  

  申克孢子丝菌酵母相刺激THP-1巨噬细胞16 h后,细胞核内NF-κB-p65较空白组荧光强度增强。

  

  结论申克孢子丝菌酵母相能诱导人THP-1巨噬细胞上调胞膜Dectin-1受体表达量并激活Dectin-1下游Syk、NF-κB、p38 MAPK信号通路。

  

  第四章申克孢子丝菌酵母相诱导人THP-1巨噬细胞Dectin-1介导固有免疫应答的机制研究目的前期研究发现,申克孢子丝菌酵母相感染后,THP-1巨噬细胞能够活化Dectin-1受体及其下游信号通路,通过诱导吞噬、ROS释放及前炎症因子分泌,引发抗申克孢子丝菌感染的固有免疫反应。

  

  本章节进一步探讨Dectin-1受体及其信号通路是否参与调节THP-1巨噬细胞抗申克孢子丝菌感染的固有免疫反应。

  

  方法首先采用小干扰RNA(siRNA)技术,建立稳定Dectin-1受体低表达的THP-1巨噬细胞模型,与申克孢子丝菌酵母相共培养,检测Dectin-1受体低表达的THP-1巨噬细胞吞噬、ROS释放水平及前炎症因子TNF-α、IL-6mRNA表达水平的变化。

  

  同时设置白皮杉醇(Piceatannol,Pic)(Syk抑制剂)抑制组,检测100nmol/LPic预处理THP-1巨噬细胞2h后Syk、IκBα、p38MAPK的磷酸化水平及吞噬能力、ROS释放水平及前炎症因子TNF-α、IL-6mRNA表达水平的变化;另设置地塞米松(p38 MAPK和NF-κB抑制剂)抑制组,检测100nmol/L地塞米松预处理THP-1巨噬细胞30 min后p38 MAPK、IκBα磷酸化水平及吞噬能力、ROS释放水平及前炎症因子TNF-α、IL-6 mRNA表达水平的变化。

  

  结果Dectin-1受体低表达的THP-1巨噬细胞与申克孢子丝菌酵母相共培养,其吞噬细胞比率、ROS释放水平及前炎症因子TNF-α、IL-6 mRNA的表达水平均较前明显降低;100 nmol/L Pic预处理THP-1巨噬细胞后与申克孢子丝菌酵母相共培养,研究发现,Pic预处理能够抑制申克孢子丝菌酵母相诱导的Syk、IκBα蛋白磷酸化水平,减弱THP-1巨噬细胞内ROS释放水平及前炎症因子TNF-α、IL-6mRNA表达水平,但对THP-1巨噬细胞吞噬能力没有影响;100 nmol/L地塞米松预处理THP-1巨噬细胞后,与申克孢子丝菌酵母相共培养,研究发现,地塞米松预处理能够降低申克孢子丝菌酵母相诱导的IκBα、p38 MAPK蛋白磷酸化水平,减弱前炎症因子TNF-α、IL-6 mRNA表达水平,但对THP-1巨噬细胞吞噬、ROS释放能力没有影响。

  

  结论Dectin-1受体参与调控THP-1巨噬细胞吞噬、ROS释放能力及TNF-α、IL-6等前炎症因子分泌;Syk活化为Dectin-1受体介导的THP-1巨噬细胞内ROS产生及前炎症因子TNF-α、IL-6分泌过程所必需,对Dectin-1受体介导的吞噬过程无影响;Dectin-1/Syk下游NF-κB及p38 MAPK信号通路参与调控前炎症因子TNF-α、IL-6分泌过程。


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