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基于SERS的细胞活性分析

  

  

  本论文将表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)光谱检测技术引入到细胞和组织分析中,将四唑盐还原法及抗体标记分析法与SERS相结合,通过改进、优化实验条件,建立了基于SERS的细胞活性和免疫细胞化学分析技术。

  

  这些方法的建立大大提高了分析检测效率以及检测灵敏度,同时简化了实验步骤,缩短了检测时间,在细胞生物学和组织化学研究领域具有很大的应用潜力。

  

  本文的主要创新成果如下:1.在3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四氮唑溴盐(MTT)比色分析法检测细胞活性的基础上,利用SERS技术作为检测手段,通过检测MTT分子以及经过活细胞中脱氢酶催化后生成的还原产物甲臜(Formazan)分子SERS光谱的变化,完成细胞活性的分析检测。

  

  结果表明,反应产物Formazan分子SERS光谱的强度与活细胞数目呈现良好的正相关性。

  

  该方法的建立使检测时间从4小时缩短到30分钟以内;检测灵敏度提高了1000倍,达到0.1 ng/m L;为细胞活性分析提供了一种更加有效、超灵敏的检测手段。

  

  2.以水溶性的2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐代替MTT分子,结合SERS检测技术改进了上述细胞活性分析方法。

  

  以SERS作为检测手段,不仅将检测时间缩短至30分钟;而且将检测灵敏度提高到0.1μM;进一步通过人MDA-MB231乳癌细胞的活性分析表明,SERS技术的超灵敏性可使细胞活性的检测由比色分析法中105个减少至50个细胞的检测。

  

  该方法的建立,集成了基于SERS技术的MTT细胞活性分析方法的全部优势,且避免了MTT分析法需加入有机溶剂二甲基亚砜对检测的干扰及对细胞所产生的毒性杀伤,使之更利于悬浮及贴壁细胞功能活性的长期活体、实时监测。

  

  3.制备了免疫胶体金检测探针,建立了基于SERS的大鼠脑皮质神经元细胞的免疫识别检测方法。

  

  将所制备的免疫胶体金探针分别引入大鼠脑皮质神经元细胞及大鼠脑皮质组织切片中,免疫识别作用之后,通过SERS手段采集拉曼标记分子的信号,以此实现对神经元细胞的定位识别以及细胞所表达的生物分子的定量分析。

  

  与原有的免疫细胞化学方法相比,该方法的优越性体现在:SERS技术的引入大大提高了检测灵敏度,我们发现当抗体浓度为6.25×10-5 mg/m L时虽早已无法使细胞显色但依然可以检测到细胞中相关生物分子的SERS信号;将SERS活性探针直接标记于一抗上,不需要加入二抗等其它抗体,简化了实验步骤;SERS探针分子与组织及细胞体系中的生物分子无特异性吸附,避免了假阳性检测结果;用探针分子的SERS光谱代替显微镜下的肉眼主观观察,实现了对待测细胞及相关目标生物分子的量化分析,使结果更为客观。

  

  4.制备了金银复合壳空心球纳米结构,并通过拉曼探针标记以及抗体修饰制备了具有生物活性的免疫SERS探针,实现了对人免疫球蛋白(Ig G)以及大鼠胰岛组织中胰岛素的检测分析。

  

  制备了SERS活性较高的金银复合壳空心球纳米粒子,其增强能力与银、金纳米粒子相比分别提高了5和20倍。

  

  将Ig G抗体修饰和4-巯基苯甲酸分子标记的金银复合壳空心球纳米粒子用于Ig G的定量分析,该方法操作简便,灵敏度高。

  

  此外,将3,3’-二乙基硫醛三碳菁化碘标记于抗体修饰的金银复合壳空心球纳米粒子,引入到了大鼠胰岛组织切片中,实现了SERS在复杂的生物组织中对胰岛β细胞及胰岛素分子的微量检测。


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