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新生期缺血缺氧对小鼠成年后抑郁症易感性及海马免疫细胞变化的影响

  新生期缺血缺氧对小鼠成年后抑郁症易感性及海马免疫细胞变化的影响


  新生期采用单侧颈总动脉结扎法(Vannucci)结合8%低氧环境建立HIBD模型,成年期后采用慢性不可预见性温和应激(Chronic Unexpected Mild Stress,CUMS)建立抑郁症模型,探讨小鼠新生儿时期经受缺血缺氧性脑损伤后成年期罹患抑郁症的易感性及其涉及的免疫学机制,为卒中后抑郁的机制研究和临床药理学研究提供一定的参考意义。


  [方法]将体重4-6g出生后第9天(P9)雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham)和缺血缺氧组(HIBD),采用左侧颈总动脉结扎法(Vannucci)建立HIBD模型,然后在环境温度为34℃-34.5℃,8%02+92%N2的混合气体中暴露45min。


  HIBD动物模型建立后,将存活的小鼠和假手术组(Sham)小鼠置于21%O2,温度为28℃的环境中连续饲养至成年期。


  第6周起(P42天),从HIBD模型小鼠中随机选取体重18-23g的小鼠随机分为缺血缺氧(HIBD)+空白对照组(control)和缺血缺氧(HIBD)+慢性应激组(CUMS);从假手术组(Sham)小鼠中随机分成假手术(Sham)+空白对照(control)和假手术(Sham)+慢性应激组(CUMS),实验组及对照组小鼠C57BL/6J每4只一笼,正常喂养。


  每天给予Sham+CUMS组和HIBD+CUMS组小鼠一种慢性不可预见性温和应激,建立抑郁症小鼠模型,而Sham+control组与HIBD+control组小鼠则不予应激,但饲养条件相同。


  通过The grip test、Hangingtest、体重和激光散斑血流成像判断HIBD模型是否建立成功;通过一系列行为学实验,包括悬尾实验、强迫游泳实验、糖水偏好实验,观察小鼠是否存在抑郁样行为;采用黑白箱实验和三箱实验观察小鼠是否存在焦虑样行为及社交功能障碍;最后应用流式细胞术检测小鼠海马组织中单核细胞、小胶质细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞的含量。


  [结果]第一部分新生鼠缺血缺氧性脑损伤模型(HIBD)的建立与评价1.从激光散斑血流成像结果显示,与Sham组相比,轻度损伤组(HIM)与重度损伤组(HIS)左侧损伤区脑血流明显下降(HIM vs Sham,F=27.44,p=0.01;HIS vs Sham,F=27.44,p<0.01);HIS组左侧损伤区血流量比HIM组显著下降(HIS vs HIM,F=27.44,p=0.04),而右侧未损伤区各组脑血流量无差别。


  2.神经功能缺损评分显示,其中Thegriptest,术后P10-P12,HIM组与HIS组抓握评分均明显低于Sham组(HIM vs Sham,p<0.05;HIS vs Sham,p<0.05);PI 1-P12,HIS组抓握评分比HIM组下降显著(HIS vs HIM,p<0.05)。


  在Hanging test中,P10-P11,HIS组悬吊时间均比Sham组悬吊时间短(HIS vs Sham,p<0.05),而HIM组与Sham无差别;P12,与Sham组相比,HIM组和HIS组悬吊时间下降明显(HIM vs Sham,F=10.38,P=0.048;HIS vs Sham,F=10.38,p<0.01)。


  3.体重结果显示,HIM组和HIS组小鼠体重增长较Sham组缓慢(p<0.001),而HIS组体重增加更加缓慢(p<0.001)。


  从术后第一天起(P10-P16),HIM组及HIS组体重均较Sham组低(HIM vs Sham,p<0.05;HIS vs Sham,p<0.05);在P14-P16,HIS组体重较HIM组显著降低(HIS vs HIM,p<0.05)。


  第二部分抑郁模型的建立与评价1.TST结果显示,与Sham组相比,应激前HIBD组静止不动时间(immobility time)低(Shamvs HIBD,t=2.35,p=0.024),随着慢性应激的开始,Sham+CUMS组与HIBD+CUMS组其静止不动时间均逐渐延长(F=5.623,p=0.001),从第1周至第3周,Sham+CUMS组静止不动时间均比HIBD+CUMS组长(Sham+CUMS vs HIBD+CUMS,p<0.05),到第4周,两组之间无差别。


  2.FST结果显示,慢性应激前,HIBD组静止不动时间比Sham组短(HIBD vs Sham,t=2.46,P=0.019)。


  随着慢性应激的开始,Sham+CUMS组与HIBD+CUMS组其静止不动时间均逐渐延长(F=11.731,p<0.001),第3周起,Sham+CUMS组与HIBD+CUMS组静止不动时间均比Sham+control组与HIBD+control组长(Sham+CUMS vs Sham+control,p<0.05;HIBD+CUMS vs HIBD+control,p<0.05),但Sham+CUMS组与HIBD+CUMS组之间无差别。


  3.糖水偏好实验结果显示,从第1周开始,Sham+CUMS组小鼠糖水偏好率便开始降低(F=33.218,p<0.001),均较Sham+control组低(Sham+CUMS vs Sham+control,p<0.05),而HIBD+CUMS组小鼠偏好率较对照组低则从第2周起(HIBD+CUMS vs HIBD+control,p<0.05)。


  4.体重结果显示,慢性应激前,HIBD组小鼠体重较Sham组低(HIBD vs Sham,t=5.83,p<0.01)。


  慢性应激后,HIBD+CUMS组与Sham+CUMS组小鼠体重均较HIBD+control组与Sham+control组低(HIBD+CUMS vs HIBD+control,p<0.05;Sham+CUMS vs Sham+control,p<0.05),但HIBD+CUMS与Sham+CUMS组之间无差别。


  5.黑白箱实验结果显示,从第1周开始,HIBD+CUMS组及Sham+CUMS组小鼠明箱累积时间逐渐降低(F=5.321,p=0.004),HIBD+CUMS组均较对照组减低(HIBD+CUMS vs Sham+CUMS,p<0.01),慢性应激第3周,Sham+CU MS组明箱累积时间较对照组下降(Sham+CUMS vs Sham+control,p<0.05),慢性应激第4周,HIBD+CUMS组小鼠明箱累积时间较Sham+CUMS组低(HI BD+CUMS vs Sham+CUMS,F=14.38,p=0.029)。


  6.三箱实验结果显示,从第2周起,HIBD+CUMS组小鼠闻嗅时间(sniff time)均比HIBD+control组降低(HIBD+CUMS vs HIBD+control,p<0.05),而Sham+CUMS组小鼠闻嗅时间则在第3周起逐渐下降(F=10.759,p<0.001);慢性应激第4周,HIBD+CUMS组小鼠闻嗅时间比Sham+CUMS组低(HIBD+CUMS vs Sham+CUMS,F=30.89,p=0.015)。


  在社交主动性阶段(Socialbility),第一周起Sham+CUMS组及HIBD+CUMS组社交主动性系数(S1/(Sl+E))逐渐降低(F=4.686,p=0.004),在第4周中,HIBD+CUMS组小鼠社交主动性系数比Sham+CUMS组降低显著(HIBD+CUMS vs Sham+CUMS,F=8.00,p=0.012)。


  在社交记忆阶段(Socialmemory),从第一周起,HIBD+CUMS组小鼠社交记忆系数(S2/(S1+S2))均较对照组降低(HIBD+CUMS vs HIBD+control,p<0.05),而Sham+CUMS组小鼠社交记忆系数则在第4周较对照组降低(Sham+CUMS vs Sham+control,F=24.24,p=0.031),HIBD+CUMS组小鼠社交记忆系数比Sham+CUMS降低明显则出现在第1、3和4周(HIBD+CUMS vs Sham+CUMS,p<0.05)。


  第三部分卒中后抑郁小鼠海马免疫细胞表达情况流式细胞术结果显示,Sham+CUMS组MDMs(CD45high/CD11b+)百分比与对照组相比出现增高(Sham+CUMS vs Sham+control,F=7.08,p=0.049),HIBD+CUMS则出现降低(HIBD+CUMS vs HIBD+control,F=7.08,p=0.014);Sham+CUMS组MC(CD45low/CD 11 b+)百分比降低(Sham+CUMS vs Sham+control,F=7.09,p=0.049),HIBD+CUMS组MC(CD45low/CD11b+)百分比增高(HIBD+CUMS vsHIBD+control,F=7.09,p=0.014);Sham+CUMS组B淋巴细胞(CD45+CD19+)百分比增高(Sham+CUMS vs Sham+control,F=19.39,p=0.002),而HIBD+CUMS组则降低(HIBD+CUMS vs HIBD+control,F=13.39,p<0.01);Sham+CUMS组T淋巴细胞(CD45+CD4+)百分比增高(Sham+CUMS vs Sham+control,F=6.55,p=0.004),HIBD+CUMS组T淋巴细胞(CD45+CD4+)百分比降低(HIBD+CUMS vs HIBD+control,F=6.55,p=0.05);HIBD+CUMS组T淋巴细胞(CD45+CD8+)百分比降低(HIBD+CUMS vs HIBD+control,F=2.89,p=0.041)。


  [结论]1.出生后第9天采用Vannucci法制备缺血性脑损伤小鼠,通过激光散斑血流成像、神经功能评定及体重变化的结果,证明成功建立缺血缺氧性脑损伤(HIBD)模型。


  2.成年期(6w)给予慢性不可预见性温和应激(CUMS)后,通过FST、TST静止不动时间(immobility time)逐渐增加,糖水偏好率逐渐下降以及体重增长缓慢等结果证明成功建立抑郁症小鼠模型。


  而FST及TST结果提示了缺血缺氧性脑损伤增加了成年后小鼠抑郁症的易感性,HIBD小鼠抑郁样行为的基础水平较低。


  3.HIBD模型组小鼠的焦虑样行为及社交功能与假手术组无明显差异,但随着慢性应激的进行,HIBD组小鼠焦虑样行为及社交功能受损更加显著。


  4.新生鼠经历缺血缺氧等负性应激事件后,成年期罹患抑郁症的发病机制可能涉及到脑内免疫细胞的参与,具体可能表现为单核细胞表达的下调、B淋巴细胞(CD19+)及T淋巴细胞(CD4+、CD8+)表达的下调和小胶质细胞表达的上调。


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