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结构鉴定及其对RAW264.7细胞的免疫调节作用

  林蛙骨肉小肽的制备与结构鉴定及其对RAW264.7细胞的免疫调节作用


  林蛙又称雪蛤,盛产于中国东北长白山地区。


  林蛙具有非常高的药用价值和营养价值,这使得它成为经济蛙中最具有经济价值的一种。


  林蛙骨肉中含有丰富的蛋白质,是良好的蛋白质来源。


  本研究以林蛙骨肉为原材料,首先通过酶法进行林蛙骨肉多肽的制备,以水解度和多肽得率为主要指标,确定林蛙骨肉多肽制备的工艺条件,然后将最佳条件下制备的林蛙骨肉多肽通过超滤、凝胶层析等技术进行分离纯化。


  将凝胶层析得到的五个组分分别收集、筛选,再用高分辨液质联用仪进行结构鉴定,筛选出优势氨基酸序列。


  最后将经过分离纯化得到的林蛙骨肉小肽进行免疫调节作用的研究。


  主要研究结果如下:1.将预处理过的林蛙骨肉为原料,以水解度为指标,分别用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶在其最适条件下对林蛙骨肉进行蛋白酶解试验,结果发现木瓜蛋白酶酶解效果好于其他蛋白酶,其中木瓜蛋白酶水解度为18.31±0.25%。


  利用单因素试验考查了pH、温度、酶解时间、加酶量(E/S)对林蛙骨肉水解度和多肽得率的影响,并以水解度为指标进行了正交实验,确定了木瓜蛋白酶酶解林蛙骨肉的最佳工艺条件为:pH为7,温度55℃,酶解时间4h,加酶量为6%,在此条件下的水解度为25.41±0.22%。


  将制备的林蛙骨肉多肽进行离心、过滤(0.45μm滤膜),再超滤分离,依次通过5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜,最终得到1000Da以下的林蛙骨肉小肽混合物。


  然后通过凝胶层析技术进一步分离纯化,考察上样量和上样浓度对凝胶层析分离纯化的影响,确定了最佳分离条件为:上样量4mL,上样浓度20mg/mL。


  将凝胶层析分离纯化得到的五个组分富集、冷冻干燥,通过RAW264.7细胞增殖实验及巨噬细胞吞噬中性红实验得出第3组分免疫活性最好;将第3组分利用液相串联质谱法(LC-MS/MS)进行结构鉴定,采集二级谱图,得到优势氨基酸序列有:LVDFLR(Leu-Val-Asp-Phe-Leu-Arg)、DLTDYLMK(Asp-Leu-ThrAsp-Tyr-Leu-Met-Lys)、SALEQTER(Ser-Ala-Leu-Glu-Gln-Thr-Glu-Arg)、LYDQHLGK(Leu-Tyr-Asp-Gln-His-Leu-Gly-Lys)、STHPHF-VR(Ser-Thr-His-Pro-His-PheVal-Arg)。


  它们的分子量分别为:381.7Da、499.7Da、467.2Da、327.5Da、487.3Da。


  对第3组样品进行免疫调节作用研究,通过实验得知林蛙骨肉小肽在75~600μg/mL范围内,均能促进细胞增殖,在浓度为1200μg/mL下细胞活性有所下降。


  通过环磷酰胺(CTX)抑制的RAW264.7细胞增殖实验得知,林蛙骨肉小肽对缓解CTX抑制细胞增殖没有明显影响。


  在巨噬细胞吞噬中性红的实验中发现随着剂量的增加细胞吞噬能力增强,林蛙骨肉小肽浓度为150~600μg/ml时作用显著(P<0.05)。


  分别测林蛙骨肉小肽对LPS活化的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-2的影响,结果发现林蛙骨肉小肽可以促进RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-2,进而具有促进免疫作用。


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