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调控巨噬细胞极化及Th细胞免疫反应

  二氢丹参酮Ⅰ调控巨噬细胞极化及Th细胞免疫反应抑制矽尘所致肺部炎症的免疫作用机制研究


  据估计全球范围内有数以千万计的工人暴露于矽尘环境之中,长期吸入矽尘将引起矽肺病,一种典型的职业性肺部疾病,尤其是在发展中国家盛行。


  职业性矽尘暴露可导致持续的肺部炎症反应,进一步引起肺组织修复异常,最终造成接尘工人残疾甚至死亡。


  由于矽肺发病进程缓慢,病理改变无法逆转,发病机理尚不清楚、有效的临床医疗方式仍在探索,因此探索矽肺疾病发生发展的机制,寻找有效的治疗药物具有重要的实际意义。


  矽肺的发生发展伴随着持续的慢性炎症病理环境,肺部炎症反应从巨噬细胞吞噬矽尘颗粒激活先天免疫反应开始,进一步激活适应性免疫应答,最终导致肺组织不可逆的损伤,因此探究矽肺炎症发生发展的免疫调控机制,并给予适当干预,或可达到延缓甚至抑制矽肺的治疗目的。


  二氢丹参酮Ⅰ,丹参的天然提取物,具有丰富的生物活性,在炎症反应中是一种重要的免疫调节剂。


  然而二氢丹参酮Ⅰ对矽尘所致肺部炎症是否具有保护作用,如何调节免疫反应以及潜在的分子调控机制尚未完全阐明。


  因此,本研究拟利用二氢丹参酮Ⅰ作为处理因素,深入探讨二氢丹参酮Ⅰ对矽尘所致肺部炎症的可能免疫调控机制,以期为职业性免疫性肺疾病的预防和控制提供新的方法和理论依据。


  研究方法:本研究采用雌性C57BL/6小鼠给予气管注入结晶型游离二氧化硅粉尘建立矽诱导肺部炎症动物模型,采用灌胃方式给予不同剂量二氢丹参酮Ⅰ建立药物治疗模型,将小鼠随机分为以下6组:(1)对照组:saline+vehicle(0.5%CMC-Na);(2)二氢丹参酮Ⅰ对照组:saline+DHI300(300 mg/kg DHI);(3)矽尘暴露实验组:CS+vehicle;(4)实验低剂量给药组:CS+DHI 75(75 mg/kg DHI);(5)实验中剂量给药组:CS+DHI 150(150 mg/kg DHI);(6)实验高剂量给药组:CS+DHI300(300 mg/kg DHI)。


  应用HE染色观察二氢丹参酮Ⅰ对矽尘所致肺部炎症的影响;使用ELISA和qRT-PCR方法检测各时间点各组小鼠肺泡灌洗液以及肺组织中炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的分泌和mRNA表达情况;通过免疫组织化学染色(F4/80)、ELISA(MCP-1)和qRT-PCR(CD68)检测二氢丹参酮Ⅰ对矽尘导致的肺部巨噬细胞聚集的影响;应用免疫组织化学和qRT-PCR方法检测二氢丹参酮Ⅰ对矽肺炎症期小鼠肺部巨噬细胞M1/M2极化的影响;通过Western blot免疫印迹方法对TLR4及其下游信号通路的变化进行检查。


  在体外采用小鼠巨噬细胞系MH-S构建矽尘暴露模型,通过qRT-PCR检测MH-S细胞中相关炎性因子、M1及M2型巨噬细胞标志分子的变化,应用免疫印迹法检测相关信号通路的变化情况。


  构建TLR4基因沉默MH-S细胞矽尘暴露模型,应用qRT-PCR技术检测各组细胞中相关炎性因子以及M1和M2型标志物的表达情况,并通过Western blot对相应通路实施检测,以说明二氢丹参酮Ⅰ调节巨噬细胞极化改善矽尘所致炎症的具体机制。


  应用吉姆萨染色和免疫荧光方法(B220)检测二氢丹参酮Ⅰ对矽尘导致肺部免疫细胞聚集的影响;使用流式细胞术分别对小鼠肺门淋巴结、脾组织中不同CD4+T细胞(Th1、Th17以及Treg)的含量比例进行检测;应用ELISA对各组小鼠肺泡灌洗液中Th相关细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-17A)的分泌进行测定;采用qRT-PCR方法检测各组小鼠肺组织或脾组织中相关转录因子(T-bet、GATA3、ROR-γt、Foxp3)或关键因子(TGF-β)的mRNA水平;通过免疫印迹法检测各组小鼠肺组织中STAT1、STAT3和其磷酸化的水平。


  结果:1、二氢丹参酮Ⅰ可以减轻矽尘导致的肺部炎症HE染色结果显示,给予矽尘暴露小鼠二氢丹参酮Ⅰ可以显著减少肺组织中炎性细胞的浸润,减轻肺部炎症反应。


  ELISA法检测肺泡灌洗液中相关促炎因子的分泌水平,结果表明,矽尘暴露小鼠给予二氢丹参酮Ⅰ后,肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌减少(P0.05),此外二氢丹参酮Ⅰ还能有效减少肺组织中Treg效应因子TGF-β的表达(P<0.05)。


  9、二氢丹参酮Ⅰ可以抑制矽尘所致肺部STAT1和STAT3的活化Western blot结果显示,与矽尘暴露组相比,给予二氢丹参酮Ⅰ的矽尘暴露肺组织中STAT1和STAT3的磷酸化水平显著降低(P<0.05)。


  结论:1、二氢丹参酮Ⅰ可通过调节肺部巨噬细胞从M1型向M2型极化,调控先天性免疫应答,减轻矽尘导致的肺部炎症。


  2、二氢丹参酮Ⅰ可通过抑制Th免疫反应,调节适应性免疫应答,减轻矽尘诱导的肺部炎症反应。


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