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脑肿瘤干细胞研究进展

  脑肿瘤干细胞研究进展
  
  摘 要:
  
  脑肿瘤是中枢神经系统的主要疾病之一,严重威胁人类健康和生命。
  
  尽管现代肿
  
  瘤的治疗取得了长足进步,但脑肿瘤因其浸润性生长、复发等特点,治疗效果仍不理想。
  
  近年来提出的脑肿瘤干细胞学说,为脑肿瘤的基础研究开辟了新的方向。
  
  该学说认为脑肿瘤干
  
  细胞(Brain Tumor Stem Cell,BTSC)是脑肿瘤的起源细胞,它可能来自中枢神经系统不同
  
  发育阶段正常干/祖细胞,并成为脑肿瘤复发和放化疗抵抗的根源。
  
  BTSC 是靶向治疗的重要
  
  靶标。
  
  关键词:
  
  神经干细胞;
  
  脑肿瘤干细胞;
  
  分子标记;
  
  靶向治疗
  
  中图分类号:
  
  R739.41
  
  1 引言
  
  近年来,肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell, CSC)[1]概念得到极大关注。
  
  肿瘤干细胞学说认
  
  为肿瘤由不同分化阶段的肿瘤细胞构成,只有处于最“上层”的一小群细胞(约占肿瘤细胞群
  
  体的0.01%-1%),即肿瘤干细胞才是造成肿瘤演进、复发和转移的根源。
  
  到目前为止,人们
  
  已经在急性髓系白血病[2-4]、脑肿瘤[5,6]、乳腺癌[7]、前列腺癌[8,9]、直结肠癌[10,11]中鉴定出了
  
  这样一小群具有无限增殖、自我更新及多向分化潜能等特性的细胞。
  
  目前常用的脑肿瘤干细胞(BTSC)的分选标记CD133 和nestin 等,同时也是神经干细
  
  胞(neural stem cell, NSC)的分选标记。
  
  寻找BTSC 特异分子标记,深入探讨BTST 的生物
  
  学特性及成瘤机理,开展针对BTSC 的靶向治疗,都是重要的研究课题。
  
  本文就正常神经干
  
  细胞与脑肿瘤干细胞的研究现状作一综述。
  
  2 NSC 与BTSC
  
  2.1 NSC
  
  在胚胎发育早期,NSC 在数量上占有绝对优势[12,13],它们通过对称分裂的方式产生保
  
  持干细胞特性的子代细胞,同时实现数量上的扩增。
  
  在进入neurogenic phase 后,NSC 通过
  
  不对称分裂的方式,产生一个与母细胞相同的子代干细胞和一个神经元前体细胞,后者继续
  
  分化为神经元。
  
  进入胶质形成期(gliogenic phase)后,继续重演上述不对称分裂方式,产
  
  生胶质前体细胞,分化为星形细胞和少突胶质细胞。
  
  至此,NSC 的数量已经大大减少。
  
  以
  
  啮齿类动物为例,从胚胎第8 天(E8)的>50%迅速缩减到E12 的10%,直至出生后一天(P1),
  
  已不到1%[12,13]。
  
  不过这样一小群干细胞在大脑发育成熟之后并未消失,它们主要集中在端
  
  脑侧脑室的脑室下区(subventricular zone, SVZ)和海马的齿状回,即成体干细胞。
  
  在猴[14]和人
  
  类[15]的成熟脑组织,仍然存在neurogenesis。
  
  此时的干细胞与胚胎早期的干细胞已不可同日
  
  而语,它们自身在分化发育的过程中获得了一些新特性,如能对生长因子发生反应等[16]。
  
  90 年代开始,由Reynolds 和Weiss[17]等开创了NSC 体外培养的先河。
  
  他们从小鼠新纹状体
  
  分离出的单个细胞能在EGF 存在的情况下增殖形成神经球(neurosphere)并能表达神经上
  
  皮标记nestin。
  
  撤去EGF 之后,神经球则分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞。
  
  然而,
  
  1高等学校博士学科点专项科研基金(项目编号:
  
  20060610053)资助。
  
  由于当时缺乏特异的细胞表面标记,如何筛选获得这样一小群细胞成为制约干细胞研究的瓶
  
  颈。
  
  直至2000 年,Uchida[18]等人将CD133 应用于NSC 的筛选获得成功之后,NSC 的基础
  
  研究才获得了长足进步。
  
  2.2 BTSC
  
  2003 年Singh[5]等人在脑肿瘤中分离到一群增殖活性较强且能在体外形成明显神经球
  
  的干细胞样细胞,连续传代后干细胞特性并未消失,并表达CD133,认为它们就是BTSC。
  
  这群CD133+(<1%)细胞较CD133-细胞群,增殖活性较强,在培养条件下可分化为与原发肿
  
  瘤表型类似的细胞,核型分析显示存在异常遗传学改变,如从髓母细胞瘤中分离得到的肿瘤
  
  干细胞较常发生10 号染色体缺失。
  
  同年,Hemmati[6]等人也在儿童脑肿瘤中分离出了BTSC,
  
  并采用RT-PCR 的方法证实其表达多种NSC 特有基因,如Musashi-1、Sox2、Bim1 和CD133
  
  等。
  
  体外分离培养BTSC 获得成功之后,一些实验小组又开始在裸鼠体内对其生物学行为
  
  进行进一步探讨[19,20]。
  
  例如,Yu[21]等证实只需要5000 个左右的GBM 神经球形成细胞,就
  
  足以在裸鼠体内形成肿瘤;
  
  而给予250,000 个非神经球形成细胞也难以在裸鼠体内形成肿瘤。
  
  BTSC 不仅存在于肿瘤组织中,也存在于培养的肿瘤细胞株中。
  
  到目前为止,已经在小
  
  鼠GL261 胶质瘤细胞株[22]和人类胶质母细胞株C6[23]、U251[24]和U87[21]等细胞株中分选出
  
  了BTSC,极大地推动了脑肿瘤干细胞的基础研究。
  
  3 BTSC 的分子标记
  
  3.1 CD133
  
  CD133(Prominin-1)是具有5 个跨膜结构域的大分子糖蛋白,分子量120kDa,最初
  
  从小鼠的原始神经上皮中分离得到[25]。
  
  人类的Prominin-1 通过鼠源AC133 单抗识别并鉴定,
  
  2000 年正式命名为CD133[26]。
  
  它的配体和功能目前尚未完全阐明,CD133 随着细胞的分化
  
  而下调[27],但在多大程度上影响干细胞的自我更新和多向分化潜能还没有定论,根据其细
  
  胞定位推测它可能与细胞的极性和运动,以及细胞和周围环境(干细胞与非干细胞之间、干
  
  细胞与细胞外基质之间)的相互作用有关。
  
  因其在筛选造血干/ 祖细胞中的价值[28,29],从发
  
  现伊始就引起了人们极大的兴趣。
  
  Bonanno [30]等人发现外周循环血中的CD133+细胞在体外
  
  培养中能向内皮细胞和心肌细胞方向分化。
  
  Bussolati[31]等人也发现从成人肾脏组织中分离出
  
  的CD133+细胞在体内体外都显示出自我更新和多向分化的能力——向内皮细胞和上皮细胞
  
  分化,推测它可能是肾组织的前体细胞。
  
  这些研究都表明,CD133 为一重要的干细胞标记。
  
  在中枢神经系统肿瘤中,不管是高度恶性的GBM和髓母细胞瘤,还是预后较好的毛细
  
  胞星形细胞瘤,都含有CD133+细胞,它与nestin一起,共同成为现阶段BTSC分离筛选的主
  
  要标记物。
  
  值得注意的是,Beier[32]等发现CD133-细胞中仍可含有具有肿瘤干性及在裸鼠体
  
  内形成肿瘤能力的干细胞,故CD133+可能不能代表整个肿瘤干细胞群。
  
  Wang[33]等人也发现
  
  最初移植给裸鼠的CD133-细胞,在随着多次体内传代之后能转变为CD133+细胞。
  
  3.2 Nestin
  
  Nestin 属于4型中间丝蛋白,主要在胚胎期和成年的神经前体细胞表达,自发现以来一
  
  直被视为神经前体细胞的标记[34]。
  
  在成熟脑组织中,nestin主要表达于SVZ区的成体神经干
  
  细胞,此外在脉络从附近也有少量表达[35]。
  
  在未分化的神经干细胞,nestin表达较强,当分
  
  化开始时细胞则下调nestin的表达而上调其他的终末分化标记,如胶质细胞中的GFAP[17,36]。
  
  然而,在大脑外伤、炎症或是肿瘤等病理情况下,已下调表达的nestin可再度表达上调[37]。
  
  在毛细胞星形细胞瘤和GBM中都能检测到nestin阳性信号[38-40]。
  
  Dahlstrand[38]等的研究显示,
  
  对比恶性程度较低的弥漫性星形细胞瘤,GBM中nestin呈强阳性表达。
  
  因此有理由相信,nestin
  
  在一定程度上可以反映肿瘤细胞的分化状态。
  
  除此之外,在GBM原代培养细胞中发现了
  
  nestin核阳性的肿瘤细胞,推测它能够通过影响细胞的染色体结构调控基因表达[41]。
  
  3.3 Musashi-1 和CD44
  
  与CD133和nestin相较,Musashi-1和CD44应用的较少。
  
  Musashi-1[42]属RNA-结合蛋白
  
  Musashi家族,进化上高度保守,主要表达于哺乳动物神经前体细胞,可以作为神经干/祖胞
  
  标记[43]。
  
  CD44属细胞间黏附分子,含有一大一小两个异构体,分子量分别为150kDa和80kDa,
  
  介导淋巴细胞归巢。
  
  在中枢神经系统,低分子量的CD44呈优势表达,在反应性增生和肿瘤
  
  性增生的星形细胞中均有表达,在中枢神经系统肿瘤中表达增高,通过与其配体透明质酸结
  
  合,介导细胞粘附和浸润[44-46]。
  
  4 BTSC 中信号通路的异常
  
  发育相关信号通路的异常被认为是维持和促进肿瘤干细胞增殖的一个重要因素。
  
  在中枢
  
  神经系统肿瘤中存在一些异常激活的信号通路,它们大多与神经发育相关,如Notch、
  
  Hedgehog等。
  
  4.1 Notch 信号通路
  
  Notch 基因最早发现于果蝇,其功能缺失导致果蝇翅缘的切迹(notch),故而得名。
  
  Notch
  
  蛋白属跨膜受体,包含4 个家族成员Notch-1,-2,-3 和-4,通过与配体(DLL-1,-3,-4 和
  
  JAG-1,-2)的相互作用调控细胞的增殖、分化和凋亡。
  
  该信号通路在进化中高度保守,涉及
  
  各种组织和器官。
  
  当Notch 受体与配体结合以后,经过肿瘤坏死因子-α 转换酶和γ-分泌酶的
  
  两次水解作用,产生一个Notch 的胞内域NICD(intra-cytoplasmic fragment of Notch),进入核
  
  内与转录因子CBF1/Su(H)/LAG1(CSL)结合,诱导下游基因转录,产生一系列生物学效应。
  
  通常情况下,Notch 通路的激活能够阻断细胞向既定方向分化,转而分化为其他类型细胞或
  
  维持细胞的未分化状态,因此被称为“gatekeeper against differentiation”[47]。
  
  在中枢神经系统
  
  中,Notch 的活化对维持NSC 的数量是至关重要的,同时也能促进胶质细胞的终末分化[48,49]。
  
  越来越多的实验证实,由Notch-1 受体介导的信号通路激活在肿瘤的形成过程中扮演重
  
  要角色,甚至可能成为靶向治疗分子。
  
  目前在一些胶质瘤细胞株中发现了Notch-1 及其配体
  
  的过表达,下调其表达,能抑制肿瘤细胞增殖,促进凋亡,且能延长胶质瘤裸鼠模型的存活
  
  时间[50]。
  
  在髓母细胞瘤中,抑制γ-分泌酶的活性,切断Notch 信号转导,能大幅减少CD133+
  
  细胞数量,抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力[51]。
  
  4.2 Hedgehog 信号通路
  
  Hedgehog 基因最早发现于果蝇,简称Hh。
  
  哺乳动物体内的Hh 家族共有3 个成员:
  
  Shh
  
  (Sonic hedgehog)、Ihh(Indian hedgehog)和Dhh(Desert hedgehog),它们共属分泌型
  
  糖蛋白,与膜上的Ptc 受体结合后,通过另一跨膜蛋白Smo 激活转录因子Gli,后者再进入
  
  核内调控下游靶基因的转录。
  
  Hh 信号通路在胚胎发育过程中起重要作用,对维持神经干细
  
  胞池的稳定必不可少[52]。
  
  在髓母细胞瘤中,Hh 信号通路异常最具代表性[53,54]。
  
  利用Hh 通路抑制剂Cyclopamine
  
  处理肿瘤细胞,除显著抑制其增殖活性外,伴随的基因改变提示细胞走向分化,在裸鼠体内
  
  的成瘤能力也随之下降。
  
  同样,在胶质瘤中也观察到了了Hh 通路的异常活化[55,56]。
  
  给予
  
  Cyclopamine 处理后,肿瘤中的SP 侧群干细胞数量明显减少,BTSC 也不再形成神经球。
  
  Xu[57]等人发现,GBM 中存在Hh 依赖和非依赖的肿瘤干细胞群体,但活化的Hh 通路维持
  
  正常的干细胞增殖活性所必需的。
  
  SHH 和PTCH1 高表达伴PTEN 表达的GBM 预后更差。
  
  这些研究表明,Hh 信号通路为一潜在的治疗靶点。
  
  5 开展针对BTSC 的分子靶向治疗
  
  如何根除BTSC 达到真正治愈肿瘤的目的成为肿瘤干细胞学说最诱人的问题。
  
  BTSC 高
  
  表达多种耐药基因,如ABCG2、BCRP1 等;
  
  较高的DNA 损伤修复能力,都使得这样一小
  
  群BTSCs 能逃过放化疗,存活下来成为肿瘤复发的根源。
  
  高通量分析方法筛选BTSC 特异的基因和蛋白,寻找特异的治疗靶点,是一个重要的研
  
  究方向。
  
  如前所述,在BTSC 中过度活化的Notch 和Hedgehog 信号通路即为候选靶位。
  
  另
  
  思路为诱导BTSC 走向终末分化。
  
  Piccirillo[58]等人发现,BMP4(bone morphogenetic protein
  
  4)能促进BTSC 的分化,进而减少CD133+细胞的数量,并降低在裸鼠体内的成瘤能力。
  
  一项实验表明,在BTSC 中过表达BMPR1B(BMP receptor 1B)后给予BMP,能促进肿瘤
  
  干细胞分化。
  
  这些研究结果为脑肿瘤的治疗提供了新方向。
  
  一些研究者主张利用NSC 对肿瘤部位的趋向性,将其作为靶向治疗药物的载体,以弥
  
  补传统手术切除对多呈浸润性生长的脑肿瘤的治疗局限[59,60]。
  
  永生化的NSC 可能在体内转
  
  化为BTSC,是该方案的局限。
  
  最近已有报道在接受NSC 移植后4 年发生脑肿瘤的病例[61]。
  
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