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拉布拉多犬骨髓间充质干细胞与牙周膜基质干细胞细胞

  拉布拉多犬骨髓间充质干细胞与牙周膜基质干细胞细胞裸鼠皮下成骨能力的比较性研究


  目的:通过体外加入骨向诱导液进行培养,观察比较犬骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)和牙周膜基质干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)的形态特征及两者在体外成骨能力的差异;再分别与支架材料β-磷酸三钙(β-TCP)复合并植入裸鼠皮下后,探索拉布拉多犬BMSCs和拉布拉多犬PDLSCs异位成骨能力的差异。


  方法:(1)犬BMSCs的培养:成年拉布拉多犬一只,将犬髂后上棘去毛后消毒,铺巾,待麻醉起效后,用骨髓穿刺针于犬髂后上棘穿刺抽取骨髓于离心管中,低速离心后将其接种于培养皿中,加入DMEM。


  待细胞培养至第3代后,取生长状态良好者,加入成骨向分化诱导液进行体外诱导培养;(2)犬PDLSCs的培养取成年拉布拉多犬一只,消毒铺巾麻醉起效后,拔取左下颌三颗下前牙,用PBS缓冲液从根尖向牙冠方向反复冲洗多次,用锐利手术刀片刮取牙根中部1/3的牙周膜组织,剪碎后接种于培养皿中,添加适量DMEM,待细胞培养至第3代后,取生长状态良好者,加入成骨向分化诱导液进行体外诱导培养。


  (3)检测方法:MTT法检测两种基质干细胞的增殖差异;骨向诱导后1d、4d、7d、14d及21d,采用碱性磷酸酶(ALP)染色法和茜素红(ARS)染色法法检测两者成骨分化情况;骨向诱导后1d、4d、7d、14d及21d,RT-PCR检测成骨诱导后成骨相关基因表达情况。


  取诱导培养7d后的第三代拉布拉多犬BMSCs和拉布拉多犬PDLSCs,分别与2mm×Φ6mmβ-TCP复合。


  实验分为3组,即β-TCP组,犬BMSCs/β-TCP复合体组,犬PDLSCs/β-TCP复合体组。


  将细胞体外与材料复合后,常规培养3d,利用扫描电镜观察细胞与材料的黏附情况。


  并将各组复合物植入裸鼠皮下,裸鼠常规饲养8周后取材,通过HE染色观察新骨形成情况,免疫组化检测成骨相关基因蛋白的表达。


  结果:(1)BMSCs原代培养7d后,在显微镜下观察可见有细胞爬出,并大量增殖,细胞呈长梭状;(2)PDLSCs原代培养7d后,显微镜下观察可见有大量细胞从牙周膜组织块中爬出,成放射状分布,细胞呈长梭状。


  两者在细胞形态上无明显差异;(3)MTT检测显示两者均有良好的体外增殖能力,其中BMSCs的增殖能力稍强;(4)ALP和ARS的染色结果显示两者随诱导时间的增加均有阳性显色,且阳性染色结果渐强,同一时间点BMSCs的染色比PDLSCs的深;(5)RT-PCR结果显示,在成骨诱导的过程中,成骨诱导相关基因BMP2、OCN、RUNX2、HIF-1α、VEGF、CLOOAGEN-1等都有明显的表达,与PDLSCs组相比,BMSC组BMP2基因在骨诱导1d表达显著高于PDLSCs组(P<0.01)但在骨诱导的7d和14d PDLSCs组BMP2基因表达要高于BMSC组(P<0.01)。


  BMSCs组OCN基因,基因在骨诱导14d时表达明显强于PDLSCs组(P<0.01)。


  RUNX2两组中都有高表达但是结果显示无统计学差异。


  BMSCs组HIF-1α,基因在骨诱导4d时表达明显低于PDLSCs组(P<0.01)。


  COLLAGEN-1 BMSCs组基因在骨诱导1d、4d、7d及14d时表达明显高于PDLSCs组(P<0.01)。


  扫描电镜结果表明犬BMSCs和犬PDLSCs均可在β-TCP支架材料上正常生长。


  两种细胞均以较高的细胞密度生长于β-TCP表面及孔隙中,与骨架材料结合较好。


  裸鼠皮下组织切片HE染色结果显示,犬BMSCs和犬PDLSCs组都有新生骨样组织形成,免疫组织化学结果显示,犬BMSCs组BMP-2和OCN表达量略高于犬PDLSCs组。


  结论:BMSCs和犬PDLSCs经体外诱导后都具有一定的成骨性能,其中BMSCs的成骨能力较PDLSCs的成骨能力强。