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人脐带间充质干细胞来源胞外囊泡在异基因造血干细胞移植

  人脐带间充质干细胞来源胞外囊泡在异基因造血干细胞移植中的作用及机制


  研究背景目前,异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是某些恶性血液病的唯一治愈方法。


  急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD)是allo-HSCT后受者死亡的主要原因。


  迄今为止尚无最佳aGVHD预防方法,亟需开发更有效的预防方案。


  间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因其独特的免疫调节及组织修复能力,成为allo-HSCT过程中细胞疗法的理想“候选者”。


  大量临床试验提示过继性输注MSCs能够预防allo-HSCT后致死性aGVHD的发生,并且能够促进造血重建。


  然而,MSCs的多向分化能力及其体内长期生存活性对受者远期影响不明,出于安全性考虑限制了MSCs的广泛应用。


  近年来研究提示胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)介导的旁分泌机制在MSCs为基础的治疗中发挥关键作用,并且越来越多的临床前及临床试验提示在组织修复及免疫调节领域,MSCs来源的外泌体及微泡有望替代MSCs发挥作用。


  研究目的本研究拟探讨人脐带间充质干细胞来源胞外囊泡(EVs released from human umbilical cord derived MSCs,hUC-MSC-EVs)在allo-HSCT中是否可以预防aGVHD和促进造血重建及可能的机制。


  研究方法及结果①Allo-HSCT小鼠模型的建立。


  BALB/c小鼠7.5Gy X射线全身照射后4-6小时内输注C57BL/6小鼠6×106骨髓细胞及3×106脾细胞。


  移植后21天左右受鼠出现明显的体重下降、活动度减少、弓背、竖毛、皮肤裸露等aGVHD临床表现。


  相应地,移植后1个月aGVHD靶器官:皮肤、肝脏、肠道出现典型的组织形态学改变。


  移植后约两个月,受鼠全部死于严重的aGVHD。


  ②hUC-MSC-EVs的分离及鉴定。


  hUC-MSCs在无血清培养基中培养48小时后收集细胞培养上清,2000g离心30分钟以去除细胞及碎片。


  上清给予两次100000g,2小时,4℃超速离心。


  PBS重悬最终EVs沉淀。


  BCA法测定hUC-MSC-EVs蛋白浓度。


  透射电子显微镜观察hUC-MSC-EVs是一群直径介于30到100纳米大小的异质性球状体。


  ③探究hUC-MSC-EVs对allo-HSCT小鼠aGVHD的预防作用。


  allo-HSCT第0天、第7天分别输注200μg hUC-MSC-EVsohUC-MSC-EVs输注组受鼠aGVHD临床表现减轻,靶器官组织形态学改变减轻,死亡率降低。


  淋巴细胞亚群检测提示hUC-MSC-EVs输注组受鼠CD3+CD8+T细胞比例及绝对值明显降低,但CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比例升高。


  此外,hUC-MSC-EVs输注组受鼠促炎细胞因子:IL-2、TNF-α及IFN-y水平降低,抗炎细胞因子:IL-10水平增高。


  与此一致,体外实验提示hUC-MSC-EVs处理组丝裂原诱导的小鼠淋巴细胞增殖受抑,且细胞因子变化模式与体内实验相似。


  ④探究hUC-MSC-EVs对allo-HSCT后小鼠造血重建的影响。


  allo-HSCT第0天输注200μg hUC-MSC-EVs。


  hUC-MSC-EVs输注组小鼠外周血象恢复时间缩短。


  体外实验发现hUC-MSC-EVs处理组小鼠骨髓细胞各系集落形成率增加。


  研究结论①成功建立了allo-HSCT小鼠模型;②差异离心法是获取hUC-MSC-EVs的有效方法;③hUC-MSC-EVs通过调节免疫反应预防allo-HSCT后aGVHD的发生;④hUC-MSC-EVs促进allo-HSCT后造血重建。