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人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞生物学特性

  人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞生物学特性及免疫抑制作用比较


  研究背景异基因造血干细胞移植(allogeneic hemotoic stem cell transplantation,allo-HSCT)是治疗各种血液系统恶性肿瘤、重型再生障碍性贫血及重症地中海贫血等的有效治疗方法,但移植相关并发症仍是威胁患者生命的重要因素,其中移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)是移植后最严重最棘手的并发症之一,急性移植物抗宿主病(aGVHD)是移植后患者非复发死亡的主要原因,其发生必须具备三个前提:①移植物中含有足够数量的识别和攻击宿主异源性抗原的免疫活性细胞;②宿主应有与移植物不同的同种异体抗原;③宿主处于免疫无能状态,对移植物不产生排斥。


  目前根据GVHD发病机制的不同,各种抗GVHD的化学药物在临床上广泛应用,如人抗胸腺球蛋白(anti-human thymocyte globulin,ATG)、抗TNF抗体英夫利昔、环孢素A(CsA)、他克莫司(FK506)等,但这些非特异性免疫抑制药物本身具有毒副作用且易导致病毒及真菌等感染,从而影响疗效。


  如何降低allo-HSCT患者移植相关死亡率、提高患者生存率及生存质量,是目前临床工作面临的挑战。


  间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)作为中胚层来源的具有多向分化潜能的多能干细胞,MSC在体外可诱导分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞等多种组织细胞,其经过多次传代培养、冻存复苏后仍具有多向分化潜能。


  且MSC具有造血支持、低免疫原性、免疫抑制及无致瘤性等特点,近年来,随着细胞替代治疗与组织工程学的不断发展,MSC已被应用于自身免疫性疾病、神经系统损伤、阿尔兹海默病、心血管疾病等多种疾病的治疗研究,在血液学方面,已被应用于GVHD的预防和治疗。


  目前骨髓仍是MSC的主要来源,在血液系统疾病方面,人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell,hBMSC)已被应用于临床治疗GVHD,但成人hBMSC细胞数量极少,并且增殖分化潜能随年龄的增大而下降,病毒感染率较高,供者hBMSC的采集须行有创性骨髓穿刺,亦使其来源受到限制。


  引起aGVHD发生、发展的主要细胞为免疫活性细胞,即供者来源的成熟T淋巴细胞在患者体内的活化,可引起其一系列的反应,继而激活并产生IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12及其受体等。


  其中IL-2和IFN-γ为Th1细胞因子,Thl细胞介导细胞免疫应答,在迟发型超敏反应、部分自身免疫性疾病、宿主体内抗胞内病原感染都起着重要作用,Th1细胞与aGVHD的发生发展也有密切关系。


  而我们知道,hAMSC具有免疫抑制作用,而且其低表达HLA-ABC和HLA-G,不表达HLA-DR表面抗原,表现出低免疫源性和免疫抑制作用,且移植到动物体内无致瘤性,是较为理想的免疫赦免细胞,为各种疾病的细胞治疗提供了新的选择。


  在异基因造血干细胞移植中,如何平衡机体内Th1/Th2细胞及Ⅰ/Ⅱ型细胞因子,对于预防和治疗GVHD具有重要意义。


  由此可见,人羊膜间充质干细胞可能为GVHD治疗新的种子细胞,具有潜在的临床应用价值。


  已有研究报道间充质干细胞几乎存在于所有的组织器官中,且不同组织来源的间充质干细胞,其体外扩增的能力也不完全相同。


  已有研究报道了脐带及胎肺来源的间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞相比,前者的体外扩增能力明显强于后者,前者可在传代40多次后仍保持原有的生物学特性及增殖能力。


  因此,目前越来越多的研究组致力于寻找新的间充质干细胞,希望能够替代骨髓间充质干细胞在临床中的应用,以解决骨髓间充质干细胞来源不足的问题。


  2004年研究者首次从人羊膜分离出间充质干细胞,经鉴定后发现其从羊膜中胚层分化而来,具有向三胚层分化的多潜能性,人羊膜间充质干细胞(humanamniotic mesenchymal stem cells,hAMSC)从健康产妇正常分娩后废弃的胎盘组织中分离培养,羊膜组织来源充足,系产后废弃物、不受伦理学限制,且羊膜不含有血管、神经、肌肉等组织,分离提纯过程相对简单、分离细胞纯度较高。


  经免疫表型鉴定,hAMSC不仅表达间充质干细胞的表面抗原,还表达干细胞相关表面抗原,如Oct-3、Oct-4、SSEA-3、SSEA-4等,这提示hAMSC可能还具有干细胞特性。


  近年来,人羊膜干细胞已经在角膜修复、烧伤性疾病、骨科疾病、脊髓损伤等相关疾病的临床研究和治疗取得疗效。


  那么,hAMSC与hBMSC生物学特性相似,均具有间充质干细胞特性,且hAMSC可能还具有干细胞特性,细胞来源更丰富,是否可成为hBMSC的替代治疗用于GVHD的预防和治疗呢?研究目的本实验通过对hAMSC和hBMSC生物学特性及对异体外周血淋巴细胞的免疫抑制功能的比较,希望为hAMSC治疗GVHD、解决hBMSC来源不足的问题提供实验依据。


  研究方法通过酶消化法从健康剖宫产产妇志愿捐献的新鲜胎盘羊膜中分离培养hAMSC,通过密度梯度离心法从健康供者志愿捐献的骨髓中分离培养hBMSC。


  实验分为两部分:第一部分实验为hAMSC与hBMSC生物学特性的比较,分别培养相同传代代数的人羊膜来源与骨髓来源的MSC,对二者进行细胞形态学观察,通过CCK-8法检测两种细胞的增殖情况并生长曲线绘制,对两种细胞进行细胞周期检测,采用流式免疫分型技术分别对两种细胞进行免疫表型鉴定,采用免疫荧光技术检测两种细胞的波形蛋白(vimentin);第二部分实验为hAMSC和hBMSC对异体外周血淋巴细胞的免疫抑制功能的比较,经丝裂霉素处理后的hAMSC与hBMSC分别与植物血凝集素(phytohemagglutinin,PHA)刺激的异体人淋巴细胞共培养,分别建立MSC与异体人外周血单个核细胞(PBMC)共培养体系,采用CCK-8法比较两种不同共培养体系中淋巴细胞的增殖情况,采用ELISA法比较两种不同共培养体系中细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)的分泌水平。


  研究结果(1)hAMSC与hBMSC细胞形态相似,hAMSC可传至15代以上,hBMSC传至第6-7代细胞后,开始老化、生长增殖能力明显减弱;(2)在细胞周期的比较中,hAMSC与hBMSC二者的G2/M期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05);(3)细胞免疫表型鉴定,hAMSC和hBMSC细胞表面均表达CD105、CD90、CD73,均不表达CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR,hAMSC表达Oct-3/4,而hBMSC不表达Oct-3/4;(4)免疫荧光检测结果显示,hAMSC与hBMSC均表达vimentin;(5)hAMSC和hBMSC均对PHA刺激的PBMC增殖具有抑制作用,且随着hAMSC和hBMSC细胞比例的增高,抑制能力增强,二者无统计学差异(P>0.05);(6)ELISA结果提示,hAMSC+PBMC+PHA共培养组上清中IFN-y水平较hBMSC+PHA+PBMC组低(P=0.056),而hAMSC+PBMC+PHA共培养组及hBMSC+PHA+PBMC共培养组分别与PBMC+PHA组上清比较,IFN-y水平明显降低(P<0.05)。


  结论hAMSC比hBMSC具有更强的增殖能力和干细胞特性,二者均有免疫抑制功能,hAMSC与hBMSC在体外均能抑制PHA刺激的异体淋巴细胞增殖并减少其IFN-γ的分泌。