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MEHP对神经干细胞增殖和迁移作用的机制探讨

  MEHP对神经干细胞增殖和迁移作用的机制探讨


  目的:观察大鼠神经干细胞及小鼠神经干细胞暴露于MEHP后,是否对神经干细胞的增殖及迁移产生影响。


  观察MEHP对增殖相关基因(GR,Stat3,Sox2)及其蛋白的影响、迁移相关的基因(Stat3,Sox2)及其蛋白的影响,并探讨其相关影响机制。


  方法:神经干细胞的获取和培养:取孕15天(E15)SD大鼠,麻醉后取其大脑皮质,分离出原代神经干细胞接种到DMEM/F12的完全培养基中进行培养,稳定传代至第二代进行MEHP暴露处理。


  细胞随机分为对照组、DMSO组、MEHP1组、MEHP10组、MEHP100组,MEHP1000组,12 h后对照组不进行处理,其他组各按照0.1%DMSO、1μmol·L-1、10μmol·L1、100μmol·L-1、1000μmol·L-1处理细胞,暴露时间为72 h。


  MEHP对神经干细胞的毒性、活力及增殖作用检测:MEHP暴露大鼠神经干细胞72 h后,CCK-8法检测细胞毒性;EdU增殖试剂盒检测神经干细胞的增殖,Transwell迁移实验检测MEHP对NE-4C细胞株的迁移能力的影响。


  剔除存在细胞毒性的MEHP1000μM剂量组,其余组进行神经干细胞及NE-4C细胞株暴露,72 h后提取细胞RNA及蛋白,标本冻存待用。


  基因及蛋白检测:荧光定量聚合酶链反应法(qRT-PCR)检测神经干细胞GR,Stat3和Sox2 mRNA表达;Western blot法检测神经干细胞GR,GRβ,Stat3,p-Stat3及Sox2蛋白表达。


  结果:MEHP作用72h后,CCK-8显示NE-4C和NSC细胞活力在1000μmol·L-1分别为73.2%±2.0%(P<0.05),68.5%±1.2%(P<0.05),和对照组相比,NE-4C和NSC细胞的活力分别减弱了70.3%和40%。


  EdU结果表明在100μmol·L-1时,NE-4C和NSC细胞的增殖率分别为80.1%±1.9%(P<0.05),75.4%±2.4%(P<0.05),和对照组相比,NE-4C和NSC的增殖能力分别被抑制了74.8%和12%(P<0.05)。


  在Transwell实验中发现100μmol·L-1MEHP处理后,NE-4C细胞的迁移率为63.4%±2.0%(P<0.05)。


  同时在NE-4C中与增殖及迁移相关的基因GR、stat3及sox2的表达下调,其表达分别为37%±23%(P<0.05),21%±15%(P<0.05),11%±5%(P<0.05),和对照组比,GR的表达减少了49.8%,Stat3为26%,Sox2则为14%。


  在NSC中与增殖和迁移相关的基因GR、stat3及sox2的表达分别为61%±13%(P<0.05),11%±7%(P<0.05),9%±4%(P<0.05),和对照组比,GR,stat3及Sox2分别降低了10%,14%和15.3%。


  在NE-4C中与增殖及迁移相关的蛋白GR、GRβ、p-stat3及sox2的表达下调0.92±0.17(P<0.05),0.87±0.35(P<0.05),0.62±0.24(P<0.05),0.81±0.22(P<0.05),在NSC中与增殖和迁移相关的蛋白GR、stat3及sox2的表达分别为0.82±0.20(P<0.05),0.56±0.12(P<0.05),0.53±0.20(P<0.05)0.84±0.36(P<0.05)。


  结论:大剂量MEHP抑制神经干细胞增殖和迁移能力。


  MEHP抑制细胞增殖可能与其抑制GRβ有关,其机制可能与MEHP抑制GRβ蛋白水平的表达,同时引起GR介导的Stat3及Sox2表达的改变共同调控NE-4C及NSCs细胞的增殖。


  大剂量MEHP对NE-4C迁移的抑制可能通过Stat3及其与Sox2的相互作用实现。