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牙囊干细胞诱导成骨的体外研究

  牙囊干细胞诱导成骨的体外研究


  目的成体干细胞具有多向分化能力,通过实验可以诱导分化成多种细胞系。


  因此,这些细胞是实现组织再生工程的关键部分。


  其中,研究最多的是造血干细胞系和间充质细胞系。


  最近,研究表明牙齿组织中的间充质干细胞存在于牙髓,牙周膜和牙囊中。


  牙囊是牙齿发育期间包绕成釉器和牙乳头的疏松结缔组织。


  而且牙囊干细胞(Dental Follicle Stem Cells,DFSC)具备干细胞特性,使其成为一种新型的种子细胞应用于牙周组织工程中。


  本实验通过体外分离培养和鉴定牙囊干细胞,并研究DFSC的成骨能力,为其在牙周组织工程中的应用提供理论基础。


  方法首先临床上选取因正畸治疗等需要拔除的第三磨牙,分别来自于身体健康的患者(12~16岁),结合组织块法和酶消化法分离培养DFSC;用有限稀释法纯化细胞,取第三代细胞用于实验;镜下观察细胞形态并记录,免疫组化染色波形丝蛋白和角蛋白鉴定细胞来源,流式细胞技术检测干细胞表面标记物CD44、CD90、CD105和CD146,CCK-8检测DFSC的生长曲线;成骨诱导1d,4d,7d,14d和21d后,通过碱性磷酸酶和茜素红染色、Real-time PCR和Western-blot检测成骨/成牙骨质细胞表面标记物的表达来评估牙囊干细胞的成骨能力。


  结果牙囊组织经酶消化法和组织块法培养,24h后可见细胞从组织块边缘爬出,培养第3天,组织块旁边可见大量长梭型细胞和少量多角形细胞,纯化的DFSC成长梭型;DFSC免疫组化染色,阳性表达波形丝蛋白,而阴性表达角蛋白;DFSC高表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD90、CD105和CD146;DFSC的生长曲线呈“S”形,前两天细胞生长缓慢,第3天开始细胞呈快速增殖趋势,第10天细胞增殖停滞,进入平台期;DFSC成骨诱导7天,碱性磷酸酶(ALP)染色阳性,随着诱导时间增加,ALP表达增强,成骨诱导14天,茜素红染色镜下可见明显的钙结节产生,随着诱导时间的增加,钙结节数量增加;随着诱导时间的增加,其成骨相关基因ALP、OCN、BMP2和RUNX2的表达明显上调(P<0.05);成骨蛋白表达趋势与m RNA水平相似,其中,BMP2、OCN、ALP和RUNX2在诱导第七天(相对于第4天)时,蛋白表达量显著增加(P<0.05),然后表达逐渐平稳(P>0.05)。


  结论DFSC易于获得且来源丰富,低免疫原性,并且不存在伦理争议,同时它具有较强的增殖和成骨能力,因此,它是牙周组织再生工程中良好的种子细胞,必将为牙周组织再生治疗开辟新的途径。