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SP5调控胚胎干细胞自我更新的作用

  SP5调控胚胎干细胞自我更新的作用


  小鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cell,mESC)分离自着床前囊胚内细胞团(Inner cell mass,ICM),不仅能通过无限增殖能力维持其自我更新(self-renewal),而且保持着多向分化的潜能。


  LIF/serum最早用于取代饲养层细胞进行mESCs培养,近年来,一些无血清培养体系的发展引起了人们的关注。


  Ying等发现在无血清培养基N2B27中,两种小分子抑制剂(2i)CHIR和PD03的加入可将mESCs维持在多潜能状态。


  这两种培养条件可通过不同通路维持nESCs自我更新,研究人员发现:在无血清培养条件下,LIF与2i中任意一种成分联合使用均可维持mESCs自我更新,提示二者在促进nESCs自我更新机制上存在重叠或具有功能上的互补。


  同时,Lyashenko等的研究表明:LIF/PD03可维持β-catenin-null mESCs自我更新,这些研究结果均表明LIF和CHIR可能通过刺激共有的靶基因维持干细胞的自我更新。


  为了筛选这些基因,我们将mESCs分别培养于LIF及LIF/CHIR条件下,并且进行全基因组表达谱分析。


  DNA Microarray结果显示:68个基因被CHIR上调超过1.5倍。


  通过与STAT3下游基因的比较,我们发现sp5、Trh可同时被CHIR及活化的Stat3上调,qRT-PCR分析进一步验证了以上发现。


  我们最终选取了sp5作为研究对象。


  鉴于LIF可上调SP5的表达,于是,我们在46C细胞中过表达sp5,并将其培养于无LIF的血清培养基中。


  结果显示:(1)PB-SP5细胞仍然具有典型的mESCs形态,碱性磷酸酶染色(AP)呈阳性,而对照组PB细胞死亡或分化,AP染色呈阴性;(2)qRT-PCR检测表明:PB-SP5细胞能高表达多潜能基因,分化相关基因表达量降低;(3)Oct4、Nanog、Klf4等免疫荧光染色呈阳性;(4)PB-SP5细胞在敲除SP5后仍具有向三胚层分化的能力。


  这些结果均表明SP5可解除nESCs对于LIF的依赖,维持mESCs的自我更新。


  同时,我们发现:(1)LIF/Stat3抑制剂能解除LIF对SP5的刺激作用;(2)撤去LIF后,Stat3活化的细胞仍然可以高表达Sp5;(3)SP5过表达可以维持Stat3敲除mESCs的自我更新。


  这些结果均表明:LIF/Stat3信号通路可上调SP5的表达维持mESCs的自我更新。


  但值得注意的是,SP5的敲低并不会损害46C mESCs的自我更新,因此,SP5可能只是LIF/Stat3促进mESCs自我更新的其中一个下游靶基因。


  鉴于CHIR同样具有上调SP5表达的能力,于是,我们将PB-SP5 ESCs培养于撤除CHIR的2i培养基中。


  结果表明:(1)SP5可部分取代CHIR对ESCs自我更新的促进作用;(2)CHIR刺激时间的延长可增加SP5的表达;(3)CHIR无法上调β-catenin-null ESCs细胞的SP5的表达。


  上胚层胚胎干细胞(epiblast stem cell,EpiSCs)分离自着床后胚胎上胚层,多种自我更新相关基因都具有重编码EpiSCs的能力。


  我们首先检测ESCs及EpiSCs中SP5的表达水平,qRT-PCR检测表明:SP5的表达没有明显差异。


  鉴于LIF/Stat3多种下游靶基因均能启动EpiSCs的重编码,恢复其ESCs状态。


  于是,我们在EpiSCs中过表达SP5,结果有部分EpiSCs呈现出典型的ESCs状态并对AP染色呈阳性,且能表达ES细胞的标志性基因。


  同时,我们对含有Oct4-GFP多潜能报告基因的OCRG9 EpiSCs进行类似处理,结果有部分细胞可激发出绿色荧光。


  这些结果均说明,SP5可以促进EpiSCs的重编码,使其回到ES状态。


  我们的研究结果表明,SP5是LIF/Stat3及Wnt/p-catenin共同靶基因,不仅可促进胚胎干细胞自我更新,而且具有重编码EpiSCs的能力。


  SP5的发现将进一步加深我们对nESCs自我更新的理解。