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帕金森大鼠模型的神经干细胞移植治疗实验研究

  帕金森大鼠模型的神经干细胞移植治疗实验研究


  [目的]帕金森病是神经科学领域研究的焦点,一直以来,科学工作者花费大量时间潜心研究帕金森病的发病机制、治疗手段,相关进展在不断跟新。


  本文主要通过体内实验来研究神经干细胞移植对帕金森病大鼠的治疗作用,及移植微环境的探讨,为临床应用提供理论依据。


  [方法]1.神经于细胞(NSCs)分离、培养、鉴定:取怀孕14-15天的SD胎鼠,显微镜下分离中脑,经胰蛋白酶消化分离制成细胞悬液,加入B27、EGF、bFGF经计数、调整细胞浓度后无血清培养。


  Nestin细胞免疫化学鉴定神经干细胞后按时半量换液培养备用。


  2.NSCs分化培养后,免疫细胞化学(TH、β-3-Tubli、GFAP)鉴定细胞分化情况。


  3.帕金森病大鼠模型建立,依照大鼠George Paxinos and Charles Watson图谱(第六版),选取260-280g(279±16.7)雄性SD大鼠,2%戊巴比妥钠(0.6ml/100g)腹腔注射麻醉,麻醉成功后于大鼠脑立体定向仪正确固定,切开头皮,保持前囟后囟在同一水平。


  以右侧前脑内侧束MFB(Medial Forebrain Bundle):(A/P:-3.6mm:L:+2.0 mm:V:-9.0 mm):腹侧被盖区VTA(Ventral Tegmental Area):(A/P:-6.0 mm:L:+0.5 mm;V:-8.0 mm);尾壳核CPu(Caudate Putamen,Striatum):(A/P:+1.2mmm;L:+2.5mm:V:-5.0)作为立体定向注射靶点,向靶点进针注入4μ16-OHDA(3μg/μl),以1μl/min缓慢注入,注射完毕停留微量进样器6min,最后再缓慢退出针头。


  术后7d,开始诱导大鼠向左侧旋转,腹腔注射APO(0.5mg/kg)10分钟后开始记录旋转圈数,每只计时5mmin,以后每7d一次,连续测试6次。


  以向左侧旋转圈数大于或等于7圈/min的大鼠作为PD建模成功的大鼠。


  4.神经干细胞移植,31只PD建模成功的大鼠随机分为2组,最后纳入统计12只/组(除去后续试验死亡):①对照组(等体积PBS),②mNSCs移植组:移植前以1200转/分离心收集细胞,以106/ul细胞密度注射。


  细胞准备好后,PD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(0.6ml/100g)麻醉,待麻醉成功,固定于立体定向仪,于右侧纹状体(A/P:+0.6 mm;L:+3.0 mm;V:-5.0 mm)用微量注射器注入51μl细胞悬液。


  分别在14天、28天、42天细胞移植后不同的时间点腹腔注射APO(0.5 mg/kg)诱导大鼠旋转。


  5.移植后14d、28d、42d,麻醉大鼠后行脑组织取材,进行WB,PCR,免疫组织荧光染色检测多巴胺能神经元相关基因、蛋白表达情况。


  6.数据统计学处理:SPSS 17.0作统计处理,数据以均数±标准差(x±S)表示,统计学检验方法用配对t检验,单因素方差分析(one-way AVONA),P>0.05无统计学差异;P<0.05存在统计学意义;P<0.001存在显著统计学差异。


  [结果]1.体外细胞培养结果显示:神经干细胞培养过程中球状悬浮生长,部分贴壁生长,Nestin鉴定阳性,分化培养后形成大量细胞间连接,TH、β-3-Tublin、GFAP鉴定阳性。


  2.动物模型诱导结果:1周vs 2周:P=0.665>0.05;2周vs 3周:P=0.047<0.05;3周vs 4周P=0.003<0.05;4周分别与1/2周比较P<0.001;5周分别与1/2/3/4周比较P<0.001;6周分别与1/2/3/4/5周比较P<0.001。


  神经干细胞移植后:(1)对照组;2周vs 4周:P=0.003<0.05;6周分别与2/4周:P<0.001;(2)神经干细胞移植组:2周vs 4周:P=0.011<0.05;2周vs 6周:P<0.001;4周vs 6周:P=0.177>0.05。


  (3)神经干细胞移植组2周vs对照组2/4/6周:P<0.001;神经干细胞移植4周vs对照组2/4/6周:P<0.001;神经干细胞移植组6周vs对照组2/4/6周:P<0.001。


  3.免疫组织荧光阳性细胞计数检测可看到神经干细胞移植组较对照组阳性细胞数有显著差异,随时间推移细胞数目呈减少趋势。


  Nestin计数结果:2/4/6周vs对照组P<0.001。


  TH计数结果:移植组各时间点与对照组比较P<0.001;移植6周vs移植2周P=0.003<0.05。


  VMAT2计数结果:2/4/6周vs对照组P<0.001;移植6周vs移植2周P=0.158>0.05。


  DAT计数结果:对照组vs移植2周P=0.015>0.05,其余相互比较P<0.001。


  Pitx3计数结果:对照组与移植2周P<0.001。


  Lmx1a计数结果:对照组vs移植4周P<0.001,移植组在移植4周较2/6周均有差异。


  神经干细胞分化为多巴胺能神经元比例约占7%-24%左右。


  4.Western Blot检测到神经干细胞组较对照组TH蛋白表达增加(P<0.001)。


  对照组各时间点比较P<0.001,蛋白表达量随时间延长逐渐降低;神经干细胞移植组4周vs对照组各时间点P<0.001;神经干细胞各时间点比较P<0.001。


  5.PCR神经干细胞移植4周vs其余各时间点P<0.001,存在显著统计学差异;对照组之间比较P值均>0.05,不存在统计学意义。


  [结论]神经干细胞移植能够在一定程度上改善帕金森病大鼠行为学,移植的神经干细胞能够分化,定植,迁移,但是分化为多巴胺能神经元数量较少,尚不能稳定有效的远期存活,任面临诸多挑战。