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小鼠卵巢生殖干细胞的建系及其基因编辑

  小鼠卵巢生殖干细胞的建系及其基因编辑


  雌性生殖干细胞(或称为卵巢生殖干细胞)具有产生新生卵子的能力,因而为治疗卵巢衰老和女性不孕不育打开了一扇新的希望之门。


  然而,获得OSCs并对其进行鉴定对于很多研究者尤其是新手而言是非常困难的。


  首先这是因为OSCs在卵巢组织中量非常稀少,很不容易获得;其次,在前人的研究中,鉴定OSCs分化为卵子通常是对卵巢组织切片进行免疫荧光或免疫组化染色来确认的;另外前人的研究中都采用鼠源而非人源的STO或者MEF作为饲养层细胞,这点对于将来人类OSCs的临床应用是有缺陷的。


  在本研究中为了克服以上弊病我们对前人的实验方案进行了适当的修改。


  首先我们将卵巢组织消化后铺到孔板中培养2-3天后再进行免疫磁珠分选(MACS)以纯化出OSCs,接着用EGFP标记OSCs并移植入受体鼠的卵巢中进行卵子定向分化的鉴定。


  受体鼠卵巢以及其后交配得到的胎鼠取出并放在载玻片上置于荧光显微镜下直接观察是否有绿色荧光的卵子或者胎鼠。


  另外,我们使用人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)替代STO/MEF作为饲养层细胞来支持OSCs的增殖。


  结果表明这些改进措施能够显著地提高和促进OSCs的获得与鉴定,而且hUC-MSCs作饲养层细胞对于将来分离扩增人类OSCs很有用处,因为这可以避免来自鼠源的污染。


  本研究的目的是在mOSCs细胞系上建立基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术平台,为将来研究与mOSCs干性维持和卵子分化的相关基因的功能与具体机制奠定基础。


  mOSCs作为卵子前体干细胞,它的出现对于生殖生物学和妇产科学的发展都具有重大意义,然而该干细胞的干性维持机制尚不明确,这直接导致目前分离建系mOSCs非常困难;另外mOSCs分化为卵子的过程和内在机制目前几乎完全空白,因此有必要对这两个重要科学问题进行研究。


  mOSCs会表达如DDX4、Fragilis、Dazl等生殖系干细胞marker,如果丧失这些基因表达会对它们的干性产生影响;而BMP4等与卵子分化的基因表达会促进原始生殖细胞(PGCS)分化发育为卵子,那么这些基因会否对mOSCs的分化产生相同作用。


  为了了解清楚这些基因在mOSCs中的功能,可以通过基因编辑技术使mOSCs的这些基因突变而丧失正确的表达,这些被敲除的基因可以通过突变的mOSCs的表型变化显示它们在mOSCs中的功能和相关通路。


  CRISPR-Case9作为目前流行的基因编辑技术,由于只需要设计一个与靶序列互补的sgRNA质粒来引导Cas9酶蛋白到靶序列位置就可实现定点基因突变,因此非常适合用来改造mOSCs的基因,实现本研究的目的。


  为此,我们首先在293T细胞系上利用CRISPR-Case9系统验证了GRIN2B基因的突变,随后将此套技术应用于mOSCs上。


  出于循序渐进之目的,首先验证了mOSCs上Tet2基因的突变,GRIN2B和Tet2都是权威文献报道了的利用CRISPR-Cas9系统得到基因突变的两个基因,选择它们是为了便于建立此基因改造体系。


  最后我们在mOSCs上进行了YAP基因的编辑,并随后通过Western blot验证其蛋白表达水平,通过CCK8实验和流式细胞周期分析验证细胞增殖能力,通过Western blot观察发生这些改变相关的通路中的关键分子。


  结果显示我们成功地在293T细胞、mOSCs上获得了GRIN2B、Tet2和YAP基因的修饰改造,Western blot也表明YAP蛋白表达水平与野生型mOSCs相比显著下调,细胞增殖实验显示YAP-’--mOSCs增殖能力明显下降,随后的Western blot表明这些增殖能力下降是因为与Bcl-2有关的凋亡增加所致,同时还发现它的机制与PI3K-mTOR通路有关。


  总的来说,通过本研究我们成功地在mOSCs细胞系上建立了CRISPR-Cas9基因编辑技术平台,而且发现了YAP基因导致凋亡增加、增殖下降,以及它的相关通路。