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神经干细胞移植治疗缺血性脑卒中的实验研究

  神经干细胞移植治疗缺血性脑卒中的实验研究


  第一章新生小鼠海马、嗅球及皮质神经干细胞的分离培养及鉴定背景:神经干细胞是指一组具有自我更新、自我复制以及定向分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞潜能的细胞群,主要存在于哺乳动物脑组织中的嗅球、海马齿状回、大脑皮质、室管膜上区、脊髓等中枢神经组织中。


  具有多向分化潜能的神经干细胞可以用于中枢神经系统疾病的治疗。


  目的:建立一套高效完整的神经干细胞分离培养鉴定体系,分别从新生小鼠海马、嗅球、皮层组织筛选出生物学性状均一的种子细胞,建立神经干细胞库,为后续研究奠定实验室基础。


  方法:分别从新生昆明小鼠分离海马、嗅球、皮层组织采用机械分离和胰酶消化法提取原代神经干细胞。


  采用无血清培养技术、机械吹打和酶消化法对提取的原代神经干细胞进行培养及传代纯化神经干细胞。


  以10%的胎牛血清诱导分化纯化的神经干细胞,细胞免疫荧光行CD133、巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白染色,鉴定神经干细胞及其分化产物。


  细胞冻存与复苏技术建立神经干细胞库。


  结果与结论:从新生小鼠海马、嗅球、皮层可提取出具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞,神经干细胞巢蛋白、CD133免疫荧光检测呈阳性;神经干细胞经胎牛血清诱导后可分化为β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。


  说明本实验室成功建立了新生鼠海马、嗅球、皮层神经干细胞体外分离培养鉴定体系。


  第二章糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化及凋亡的影响背景:缺氧作为神经系统疾病发展过程中诸多病理因素中最常见的因素之一,对于内源性神经干细胞以及移植后外源性神经干细胞的存活、迁移、分化、凋亡发挥着诸多调控作用。


  目的:系统观察体外培养环境下,糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化、凋亡的影响。


  方法:从新生鼠嗅球分离培养出神经干细胞,建立糖氧剥夺模型,将神经干细胞分为常氧组和缺氧组,免疫荧光技术检测糖氧剥夺后神经干细胞分化能力,MTT法检测糖氧剥夺24,48 h后恢复正常条件培养对神经干细胞增殖能力的影响,Hochest33258荧光染色检测糖氧剥夺24,48 h时后神经干细胞凋亡状况。


  结果与结论:第4代神经干细胞CD133免疫荧光鉴定结果呈阳性表达,MTT细胞增殖能力检测结果示:糖氧剥夺组增殖能力明显低于常氧组(P<0.05),糖氧剥夺48 h组增殖能力低于糖氧剥夺24 h组(P<0.05)。


  GFAP、β-TubulinⅢ细胞免疫荧光染色结果示糖氧剥夺48 h时后神经干细胞分化为星型胶质细胞、神经元总数明显低于常氧组(P<0.05)。


  Hochest33258染色凋亡率检测结果示糖氧剥夺组细胞凋亡率明显高于常氧组(P<0.01),糖氧剥夺48 h组神经干细胞凋亡率显著高于糖氧剥夺24 h组(P<0.01)。


  上述结果表明糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化、凋亡造成不利影响,影响程度取决于神经干细胞对于缺氧浓度、缺氧时间及自身对于缺氧的耐受性有关。


  第三章光化学栓塞法建立缺血性脑卒中动物模型背景:实验性缺血性脑卒中动物模型作为研究缺血性脑卒中病理机制以及研究开发新治疗方案必不可少的工具,光化学栓塞法制作缺血性脑卒中动物模型操作简便,稳定性好,重复性高,研究人员可以针对性的控制梗死灶的位置以及大小,是研究缺血性脑卒中病理机制的良好选择。


  目的:建立光栓法缺血性脑卒中动物模型,对比分析性别差异在缺血性脑卒中后梗死体积以及行为学表现的异同。


  方法:实验组分为病理学检测其中模型组(n=3)、假手术组(n=3)各组于建模第7d行尼氏染色和Fluoro-Jade C染色观察梗死后病理学变化;梗死体积测试组:其中雌性组(n=8)、雄性组(n=8)各组于建模第7d行计算梗死体积大小;行为学测试组:雌性假手术组(n=10),雌性模型组(n=10),雄性假手术组(n=10),雄性模型组(n=9)各组于建模后1、2、3、5、7d行疲劳转棒测试和前肢抓力测试。


  假手术组小鼠不注射孟加拉玫瑰红,其余步骤同模型组。


  结果与讨论:尼氏染色可见梗死中心神经元变性坏死,空泡样病理改变,Fluoro-Jade C染色可见变性神经元阳性表达,雌性组梗死体积显著小于雄性组,模型组行为学运动功能受损程度显著大于假手术组,其中雌性组运动功能受损程度小于雄性组。


  以上结果表明光栓法可以成功建立缺血性脑卒中动物模型,且相同实验室参数前提下,缺血性脑卒中对于雄性造成的神经功能损伤更为严重。


  第四章神经干细胞移植促进光化学栓塞动物模型的运动行为功能恢复背景:缺血性脑卒中为各种原因所致的脑部血液供应障碍,导致局部脑组织缺血缺氧性坏死,而出现相应神经功能缺损的一类临床综合征。


  是危害中老年人身体健康和生命的主要疾病之一。


  在过去几十年中,其发病率和死亡率持续性增加,尤其在发展中国家给患者和家属带来了严重的精神和经济负担。


  从新生小鼠海马分离出的具有向神经元以及胶质细胞分化能力的神经干细胞,为缺血性脑卒中的治疗方式带来的新的曙光。


  目的:观察神经干细胞移植治疗光化学栓塞脑卒中模型的效果。


  方法:实验组分为病理学检测组其中移植组(n=6)、假手术组(n=6)各组于移植后7d行尼氏染色和Fluoro-Jade C染色观察梗死后病理学变化;梗死体积测试组:其中神经干细胞移植组(n=6)、假手术组(n=6)各组于移植后第7d行计算梗死体积大小;行为学测试组:雄性神经干细胞移植组(n=10),雄性假手术组(n=10),雄性模型组(n=10)各组于建模后1、2、3、5、7、14、21、28d行疲劳转棒测试和前肢抓力测试。


  假手术组小鼠不注射孟加拉玫瑰红,其余步骤同模型组。


  结果与讨论:尼氏染色结果显示较假手术组,移植组梗死体积显著降低16.32%。


  (假手术组:27.93±2.8mm3,n=6,神经干细胞移植组:23.37±2.25mm3,n=6,p<0.05)。


  此外,行为学测试中,神经干细胞移植组运动功能表现显著高于假手术组及对照组。


  说明神经干细胞移植是一种治疗缺血性脑卒中的有效治疗手段。