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猪胚胎来源干细胞建系方法的初步研究

  猪胚胎来源干细胞建系方法的初步研究


  哺乳动物胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)和滋养层干细胞(trophoblast stem cells,TSC)均属于胚胎来源的干细胞,由早期胚胎或内细胞团(inner cell mass,ICM)培养而来。


  胚胎干细胞已经在小鼠、人、猴子和大鼠上成功建系,滋养层干细胞也已经在小鼠、人、兔子和猴上成功建立。


  但无论是胚胎干细胞还是滋养层干细胞,在有蹄类大动物上均未取得成功。


  由于猪在体型和相关生理功能方面都与人类十分接近,所以猪胚胎干细胞和滋养层干细胞是研究人类相关基因疾病以及异种移植的最佳模型。


  本研究初步摸索猪滋养层干细胞的建系方法;同时构建高表达白血病抑制因子(leukemia inhibitor factors,LIF)的饲养层细胞,并构建猪源转录因子表达载体,以期提高猪胚胎干细胞的质量及建系效率。


  目的通过接种体外受精囊胚,建立猪滋养层干细胞系;建立高效表达猪LIF的STO细胞系,优化猪胚胎干细胞的培养条件;构建猪源转录因子表达载体,辅助猪胚胎干细胞建系。


  方法1.通过接种体外受精囊胚,建立猪滋养层干细胞系:通过体外受精和发育培养获得第6天囊胚,去除透明带后将全胚接种于STO饲养层上,用FGF系统干细胞培养液培养滋养层干细胞,并利用机械切割的方法进行传代,通过形态学和碱性磷酸酶染色方法鉴定其干细胞特性。


  2.通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体pCAG-pLIF转染至小鼠STO细胞中,通过药物筛选获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-pLIF细胞)。


  通过QPCR、Western blot等方法检测STO-pLIF细胞中猪LIF的表达量。


  选择高效表达猪LIF的STO-pLIF细胞作为饲养层,培养大鼠诱导多能性干细胞(induced pluripotency stem cells,iPS)。


  通过生长曲线检测、碱性磷酸酶染色、干细胞多能因子的RT-PCR检测和免疫荧光染色等方法,检验STO-pLIF细胞饲养层在大鼠iPS细胞培养方面的功能。


  3.以猪胚胎成纤维细胞(pig embryonic fibroblast,PEF)的cDNA为模板,合成或扩增猪源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5五个转录因子,利用PCR方法,将REX1、LIN28、DPPA5以E2A和T2A序列连接成3因子片段并通过测序检测其准确性,将商业构建的OCT4和TBX3以及自行构建的三因子片段分别经过限制性内切酶酶切后连接到诱导表达载体pTRE3G-ZsGreenI中,获得三个重组表达载体。


  为了验证所构建质粒功能,将猪源OCT4重组表达载体和pEF1a-Tet3G质粒共转入PEF细胞中,并在细胞培养时添加强力霉素(DOX)诱导外源转录因子表达,通过QPCR检测载体中猪源OCT4的表达情况。


  结果1.所建立的滋养层干细胞系最高传代至第9代,逐渐出现较多油滴,无法继续传代;由于传代受限,无法有效扩增细胞系,后续的核型鉴定和碱性磷酸酶染色结果均不理想。


  2.获得猪LIF转基因阳性STO细胞系,STO-pLIF细胞中LIF基因和蛋白的表达量均有上调;该细胞系作为饲养层所培养的大鼠iPS细胞在形态、多能性因子表达方面更接近于含LIF的传统培养液培养的大鼠iPS细胞,显著优于无外源LIF添加的培养液所培养的大鼠iPS细胞。


  3.成功构建猪源转录因子重组表达载体,在猪源OCT4重组表达载体与pEF1a-Tet3G质粒共转PEF细胞并经DOX诱导表达后,利用QPCR检测发现其有效提高了PEF细胞中OCT4转录因子的表达量。


  结论1.尽管接种体外受精囊胚能够形成滋养层干细胞,但是由于培养条件、传代方法等问题仍然无法稳定传代,还需进一步优化方法。


  2.成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-pLIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠iPS细胞培养中具有一定优势。


  3.成功构建猪源转录因子的重组表达载体,将进一步利用其转染的PEF细胞诱导形成iPS细胞或辅助建立猪胚胎干细胞系。