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miR-192对肺腺癌肿瘤干细胞调控作用的研究

  miR-192对肺腺癌肿瘤干细胞调控作用的研究


  目的:1.探讨应用顺铂联合无血清悬浮培养法筛选并富集肺腺癌肿瘤干细胞的可行性;2.探讨miR-192在肺腺癌干细胞和亲代细胞中的表达差异;3.初步探讨mi R-192对肺腺癌细胞及肺癌干细胞干细胞特性的调控作用。


  方法:1.将人肺腺癌细胞系PC9应用顺铂筛选后于无血清的DMEM/F12培养基的中培养3周。


  2.应用CCK-8法绘制生长曲线比较CSCs与PC9细胞增殖能力的差别;应用平板克隆实验对比CSCs与PC9细胞的克隆能力;应用流式细胞仪检测CSCs与PC9细胞中SP细胞比例的差别;应用RT-PCR技术及Western-blot检测CSCs与PC9细胞中干细胞标志物的表达差别。


  3.应用RT-PCR技术检测CSCs与PC9细胞中mi R-192的表达差异。


  4.应用悬浮培养法分别比较miR-192及miR-192 inhibitor对CSCs、PC9细胞成球率的影响;应用CCK-8法绘制生长曲线比较miR-192及miR-192 inhibitor对CSCs、PC9细胞增殖能力的影响;应用流式细胞技术比较miR-192及miR-192inhibitor对CSCs SP细胞比例的影响;应用流式细胞技术比较miR-192对PC9细胞周期的影响;应用RT-PCR技术和Western-blot技术比较miR-192及miR-192inhibitor对CSCs、PC9细胞干细胞标志物表达水平的影响。


  结果:1.经顺铂联合无血清培养筛选后,CSCs细胞形态与亲代PC9细胞存在显著差别;2.细胞生长曲线及平板克隆实验提示PC9-CSC具有更强的增殖能力(P<0.000),(P=0.003);3.PC9-CSC较PC9细胞中SP细胞含量显著增多(13.16±1.12%vs.1.21±0.64%)(P<0.000);4.pc9-csc中abcg2、cd133、oct4、nanogmrna表达显著高于亲代pc9细胞分别为亲代pc9细胞的3.44±0.12、2.06±0.11、5.51±0.20、6.04±0.22倍(p<0.000~0.000);5.pc9-csc中abcg2、cd133、oct4、nanog蛋白表达水平高于亲代pc9细胞,灰度值分别为亲代pc9细胞的1.54±0.13,1.19±0.08,1.372±0.11,1.31±0.12倍(p=0.002~0.012);各组细胞的内参蛋白β-actin表达水平一致(p>0.05);6.pc9-csc中mir-192表达量较亲代pc9组显著增高4.21±0.46倍(p<0.000);7.pc9转染mir-192mimic后成球率增高(17.00±3.00vs.54.22±13.53)(p=0.009);pc9-csc转染mir-192mimic后成球率增高(153.667±14.74vs.107.00±11.00)(p=0.008);pc9-csc转染mir-192inhibitor后成球率较pc9-csc降低不显著(92.00±7.00vs.112.333±12.51)(p=0.406);8.生长曲线提示pc9转染mir-192mimic后增殖能力增强(p<0.000);pc9-csc转染mir-192mimic后增殖能力增强(p<0.000);pc9-csc转染mir-192inhibitor后增殖能力降低(p<0.000);9.pc9-cscs转染mir-192mimic后sp细胞含量增多(16.32±0.87%vs.13.26±0.74%)(p=0.018);pc9-csc转染mir-192inhibitor后sp细胞含量减少(9.43±0.71%vs.12.76±0.54%)(p=0.002);10.细胞周期结果显示,pc9转染mir-192mimic后g2/m期比例显著增高(28.1±0.5%vs13.4%±0.3)(p<0.000);11.rt-pcr结果显示,pc9转染mir-192mimic后abcg2、cd133、oct4、nanogmrna表达显著增高,分别为对照组的2.19±0.12、2.06±0.11、3.21±0.21、2.89±0.27倍(p<0.000~0.001);pc9-csc转染mir-192mimics后abcg2、cd133、oct4、nanogmrna表达显著增高,分别为对照组的1.61±0.14、1.42±0.13、1.49±0.17、1.34±0.12倍(p=0.004~0.033);pc9-csc转染mir-192inhibitor后abcg2、cd133mrna表达降低,分别为对照组的0.73±0.09、0.62±0.14倍(p=0.020~0.041),oct-4、nanog降低不显著(p>0.05);12.westernblot结果结果显示,pc9转染mir-192mimic后cd133蛋白表达显著增高,灰度值为对照组的1.18±0.04倍(P=0.002),abcg2、oct4、nanog灰度值与对照组无显著差异(P>0.05);PC9-CSC转染miR-192 mimic后oct4、nanog蛋白表达显著增高,灰度值分别为对照组的1.12±0.04、1.13±0.03倍(P=0.003~0.014),abcg2、cd133灰度值与对照组无显著差异(P>0.05);PC9-CSC转染miR-192 inhibitor后abcg2、cd133、oct4、nanog蛋白表达显著降低,灰度值分别为对照组的0.88±0.04、0.90±0.04、0.87±0.02、0.90±0.02倍(P=0.001~0.026);各组细胞的内参蛋白β-actin表达水平一致(P>0.05)。


  结论:1.利用顺铂联合无血清悬浮培养技术能够筛选并富集肿瘤干细胞。


  2.筛选出的CSCs具有更强的增殖能力、更高的SP细胞比例、更多的干细胞标志物表达等干细胞特征。


  3.miR-192的表达量在富集的CSCs中显著增高,并且可能对肺腺癌肿瘤干细胞发挥调控作用。