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肠道菌群失调对免疫细胞及细胞因子的影响

  肠道菌群失调对免疫细胞及细胞因子的影响


  作者:张亚超王沛张玉玲孙晓丽刘颖王仁杰


  【摘要】目的探讨菌群失调对机体免疫细胞和细胞因子的影响。方法用卡那霉素制作小鼠肠道菌群失调的动物摸型,进行肠道菌群的定量分析,同时进行免疫细胞和细胞因子相关指标的测定。结果实验组小鼠肠道内菌群数量明显低于对照组(P<0.01)。菌群失调后实验组小鼠较对照组脾细胞数、脾抗体形成细胞数减少,脾重量减轻(P<0.05或P<0.01);实验组小鼠血清白细胞介素-2(IL2)和粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的含量较对照组低(P<0.01)。结论肠道菌群失调可减少机体的免疫细胞及降低细胞因子。


  【关键词】小鼠;菌群失调;免疫细胞;细胞因子


  人和动物体内存在大量有益菌,这些菌不但对机体无毒、无害,而且参与宿主的消化、营养、代谢、吸收、免疫及抗感染的过程。大量研究证明,它在维持机体健康的微生态平衡中起着重要的作用。我们应用抗生素脱污染使小鼠肠道菌群失调,然后观察对机体免疫细胞及细胞因子的影响。


  1材料和方法


  1.1实验动物


  纯系BALB/C小鼠80只,8周龄,体重18~22 g,雌雄各半,由河北医科大学实验动物学部提供。


  1.2实验材料


  卡那霉素由中国药品生物制品鉴定所提供;非选择性培养基和选择性培养基EMB、EC、BS、LBS(分别培养肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌)均由天津金章医用新技术研究所提供;豚鼠补体由本实验室制备。


  1.3实验方法


  1.3.1动物模型制备[1]


  将实验动物随机抽取实验组和对照组,每组10只。实验组小鼠卡那霉素50 mg(稀释量为0.4 ml)灌胃,每天上午1次,连续10 d;对照组小鼠蒸馏水0.4 ml灌胃,方法及天数同实验组。所有小鼠10 d后采取摘眼球放眶血方法处死,盲肠内容物用于肠道菌群的培养,验证动物模型是否准确建立。


  1.3.2小鼠肠道菌群和脾重量的检测


  实验组和对照组小鼠各10只,按上述方法制作动物模型,然后放眶血处死。取盲肠内容物0.1 g,置于放有玻璃球的小瓶中,加入0.9 ml无菌生理盐水,加盖,200 r/min在振荡器上振荡15 min,均质化的标本稀释度为10-1,从此混合液中吸取0.2 ml,再加1.8 ml无菌生理盐水,混匀,此标本稀释度为10-2,继续进行10倍稀释至10-8。采用Mile与Misra所介绍的方法接种,每个稀释度定量接种3个液滴。选择适当的计算菌落的稀释度进行菌落计算。结果以Log的菌落形成单位/克(CFU/g)表示。小鼠处死后用75%酒精浸泡2 min,取出后固定在蜡盘上,解剖腹腔,将脾脏与周围组织分离取出,用滤纸吸除黏附的血液后,称重。


  1.3.3脾抗体形成细胞(PFC)测定


  实验组和对照组各10只小鼠,每日每只50 mg卡那霉素灌服。服药3 d后,同时用绵羊红细胞(SRBC)免疫,5%SRBC腹腔注射0.4 ml,连续免疫4 d,再喂药7 d后,断颈处死小鼠,取出脾脏。将小鼠脾脏用100目钢网和注射器芯研磨制成单个脾细胞悬液,用Hank液洗两遍,1 000 r/min,离心15 min,每个脾细胞加6 ml Hank液混匀。取24孔板,每孔加180μl Hank液,50μl 1∶3稀释的豚鼠补体,50μl 10%SRBC,20μl脾细胞,混匀,填充小室,蜡封小室边缘,37℃1.5 h温箱孵育,计数小室内空斑数量。


  1.3.4白细胞介素(IL)2和粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)测定


  实验组和对照组各10只小鼠,模型建立和免疫同上,小鼠摘眼球处死,取眼眶静脉血于试管中,静置1 h后,离心,取血清。采用双抗体夹心ELISA法分别按照试剂盒说明进行检测。待测血清中的IL2、GMCSF与包被抗小鼠IL2、GMCSF单抗体结合,加入酶标抗体后形成复合物,后者与底物作用呈现显色反应,429 nm处测OD值,IL2、GMCSF浓度与OD值成正比。检测程序:①建立标准曲线;②加样:待测品孔每孔各加入待测样品100μl;③将反应板充分混匀后置37℃,120 min;④洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,滤纸上印干;⑤每孔中加入第一抗体液50μl,将反应板置37℃,60 min,洗板同前;⑥每孔加酶标抗体工作液100μl,将反应板置37℃,60 min,洗板同前;⑦每孔加底物工作液100μl,置37℃暗处反应5~10 min,每孔加入1滴终止液混匀;⑧在429 nm处测吸光度值;⑨在半对数纸上画出标准曲线,根据样品的A值在曲线上查出相应的IL2、GMCSF含量。


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