首页 >> 免疫细胞研究 >>免疫细胞市场 >> 表达BTLA的树突状细胞对C57BL/6小鼠EAE免疫耐受作用的初步研究
详细内容

表达BTLA的树突状细胞对C57BL/6小鼠EAE免疫耐受作用的初步研究

  表达BTLA的树突状细胞对C57BL/6小鼠EAE免疫耐受作用的初步研究


  多发性硬化是一种累及中枢神经系统白质的自身免疫性脱髓鞘性疾病,有效阻止疾病的复发或进展一直是治疗多发性硬化的难题。


  目前诱导机体产生特异性免疫难受被认为是极具前景的治疗多发性硬化的方法。


  实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是由CD4+T细胞介导的理想的多发性硬化研究模型,在EAE发病机制中Th1/Th2细胞分化失衡发挥着重要影响,Th1类细胞因子发挥致病作用,Th2类细胞因子与病情缓解相关。


  B和T淋巴细胞衰减子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)是一种重要的可以抑制T细胞活化的负性共刺激分子。


  树突状细胞(dendritic cell,DC)作为重要的抗原提呈细胞为T细胞活化提供第一信号,而其本身又可以通过多种机制诱导对T细胞特异性抗原的耐受,但单纯的DC无法完全抑制EAE的免疫反应。


  本研究旨在通过慢病毒作为载体在树突状细胞过表达BTLA蛋白,增强树突状细胞的耐受性之后研究其是否可以负性调节CD4+T细胞介导的EAE的免疫反应,从而为特异有效地阻止MS复发与进展,重建自我耐受提供实验基础。


  方法:1、构建携带BTLA基因的重组慢病毒载体。


  根据GeneBank公布的小鼠BTLA的mRNA序列构建ORF慢病毒表达质粒,在Lenti-Pac HIV表达包装试剂盒作用下包装于293Ta细胞中,得到携带BTLA基因的重组慢病毒载体。


  2、原代分离培养C57BL/6小鼠骨髓源性树突状细胞。


  采用改良Inaba法,无菌手术取出小鼠胫骨、股骨并吹出骨髓后,在6孔细胞培养板中,使用粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulatinactor factor,GM-CSF)和白介素-4(interleukin 4,IL-4)进行联合诱导,隔天进行半量换液并在光镜下观察树突状细胞状态。


  3、携带BTLA基因的重组慢病毒载体转染C57BL/6小鼠骨髓源性树突状细胞。


  在树突状细胞培养4天后,收集树突状细胞铺于12孔细胞培养板中,24小时后当树突状细胞融合度达到70%时,以MOI(感染复数:病毒数量/细胞数量)=15向细胞培养孔中加入携带BTLA基因的重组慢病毒液。


  4、过表达BTLA的树突状细胞的鉴定。


  重组慢病毒转染树突状细胞96小时后在荧光显微镜下观察,若有绿色荧光即表示转染成功,树突状细胞上有BTLA表达;采用RT-PCR检测BTLA基因的转录水平;使用流式细胞检测技术对转染了携带BTLA基因的重组慢病毒的树突状细胞进行表型检测。


  5、构建C57BL/6小鼠EAE模型。


  使用人工合成MOG35-55多肽并在结核菌素、弗氏佐剂、百日咳素的共同作用下,以腹股沟、腋下多点皮下注射的方式主动免疫C57BL/6雌性小鼠。


  每日对小鼠进行称重并进行行为学评分。


  6、EAE小鼠CD4+T细胞与树突状细胞建立共培养体系后探索过表达BTLA的树突状细胞对EAE小鼠免疫反应的影响。


  EAE造模成功后在小鼠发病高峰时取小鼠脾脏,原代分离脾细胞后磁珠分选CD4+T细胞。


  过表达BTLA的树突状细胞与EAE小鼠CD4+T细胞以1:10的比例建立共培养体系,空载慢病毒(不携带BTLA基因)转染的树突状细胞与EAE小鼠CD4+T细胞建立的共培养体系为阴性对照组,单纯树突状细胞与EAE小鼠CD4+T细胞建立的共培养体系为空白对照组。


  72小时后收集各共培...  


  文章来源于网络,版权归原作者所有。


贵州泛特尔细胞
咨询热线: 400-048-9990  
邮       箱:1027014116@qq.com
咨询QQ: 1027014116   

手       机:15180725452
传       真:010-12345678
公司地址:贵州省贵阳市金阳高新产业园都匀路109号 
关注微信公众号!

Copyright2014-2025All rights reserved  版权所有   使用条款 | 隐私 | 商标与版权 | 网站地图