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人静脉用免疫球蛋白抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞炎症介质释放

  人静脉用免疫球蛋白抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞炎症介质释放及其机制的研究


  研究目的:在本研究中我们拟以星形胶质细胞(AST)分泌细胞因子的调控为切入点,通过在星形胶质细胞的体外炎症模型研究人静脉用免疫球蛋白(IVIG)对AST分泌细胞因子的影响;进一步研究MAPK信号通路在IVIG抑制AST分泌细胞因子中所起的作用,探讨IVIG通过AST发挥抗炎作用的靶点,旨在为中枢神经系统免疫炎症性疾病的治疗提供理论及实验依据。


  研究方法:1、原代星形胶质细胞培养、纯化及鉴定:取生后1-2d BALB/c小鼠,无菌操作下取脑,制成胶质细胞悬液,经差速粘附法及摇床机械振荡法获得纯化的星形胶质细胞,然后进行免疫荧光鉴定,细胞纯度在95%以上可用于后续实验。


  2、MTT法检测细胞活性:将纯化的星形胶质细胞按一定细胞浓度接种于96孔板,加入不同浓度(0.1、1、5和10mg/ml)的人静脉用免疫球蛋白孵育24h,用MTT法检测不同浓度人静脉用免疫球蛋白对星形胶质细胞活力的影响。


  3、ELISA法测IL-6、TNF-α的含量:实验分为对照组、LPS组及IVIG处理组(浓度分别为0.1、1、5和10mg/ml),将纯化的星形胶质细胞接种于48孔板,IVIG组每组加入不同浓度的IVIG分别预处理4h、8h、12h、24h后,LPS组和IVIG组同时用1ug/ml LPS刺激24h后收集上清液,用ELISA法测IL-6、TNF-α含量。


  4、Western blot测MAPK通路蛋白的表达:实验分为对照组、LPS组及IVIG处理组(浓度分别为0.1、1、5和10mg/ml)。


  IVIG组每组加入不同浓度的IVIG预处理24h后,LPS组和IVIG组用1ug/ml LPS刺激8h后收集细胞总蛋白,用western blot检测MAPK通路蛋白(JNK、ERK、p38MAPK)的表达。


  实验结果:1、人静脉用免疫球蛋白对星形胶质细胞活力的影响:为了明确IVIG对星形胶质细胞的抗炎作用不是通过其细胞毒性作用导致的,首先必须了解IVIG的细胞毒性作用。


  MTT结果显示IVIG对星形胶质细胞活力无明显影响,差异无统计学意义,分别为0.1mg/ml(95.03±1.739%)、1mg/ml(96.17±3.125%)、5mg/ml(91.89±2.008%)、10m/ml(93.98±2.256%),因此可选择上述IVIG的浓度用于后续试验。


  2、人静脉用免疫球蛋白对脂多糖诱导的星形胶质细胞分泌细胞因子的影响:ELISA结果示:在1ug/ml LPS刺激24h的条件下,星形胶质细胞分泌TNF-α、IL-6的量最高,差异具有统计学意义,可用于后续的实验。


  LPS组IL-6、TNF-α含量较对照组明显升高,IVIG组IL-6、TNF-α含量较LPS组明显降低,差异具有统计学意义,说明IVIG能明显抑制LPS诱导的星形胶质细胞分泌IL-6、TNF-α。


  3、人静脉用免疫球蛋白对脂多糖诱导的星形胶质细胞MAPK活性的影响:Western Blot结果示:LPS组星形胶质细胞p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK蛋白表达较对照组升高。


  LPS+IVIG组p-ERK和p-JNK表达较LPS组无明显变化,p-p38MAPK表达降低。


  提示IVIG抑制LPS诱导星形胶质细胞p38MAPK的磷酸化。


  结论:1、人静脉用免疫球蛋白对星形胶质细胞的活力无明显影响;2、人静脉用免疫球蛋白能有效抑制炎症状态下星形胶质细胞分泌细胞因子;3、人静脉用免疫球蛋白抑制炎症状态下星形胶质细胞分泌细胞因子的作用可能与抑制p38MAPK途径的激活有关。


  关键词:人静脉用免疫球蛋白、炎症、星形...  


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